長鏈非編碼rna afap1-as1的引物、檢測試劑及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的引物、檢 測試劑及其應用。
【背景技術】
[0002] 人類基因組計劃及其后續的DNA元件百科全書計劃（The Encyclopedia of DNA Elements Pr〇ject，ENC0DE)研宄成果表明，蛋白編碼基因序列僅占人類基因組序 列的1-3%，而人基因組中絕大部分可轉錄的序列為長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)。LncRNA廣泛地存在于各種生物中，且隨著生物復雜程度的升高，基因組中 IncRNA序列的比例也相應地增大，提示IncRNA在生物進化過程中有重要意義。隨著IncRNA 不斷被發現，它們的功能逐漸被詮釋，科學家們發現IncRNA廣泛而活躍地參與到生命活動 不同層面的功能調控中，作為一個嶄新的領域，已經成為國際生命科學研宄領域新的前沿 與熱點。
[0003] LncRNA可作為功能蛋白質的信號（signal)、誘導（guide)、誘館（decoy)或支架 (scaffold)分子等多種方式，在染色質重構、基因轉錄、翻譯及蛋白修飾等多重水平調控基 因的表達，并在包括發育、免疫、生殖等基本生理過程中扮演了不可替代的角色，更重要的 是，IncRNA的表達與功能失調已經與包括惡性腫瘤在內的人類多種疾病緊密聯系在了一 起。因此，深入研宄IncRNA的功能，揭示由IncRNA介導的遺傳信息傳遞方式和表達調控網 絡，不僅可以從蛋白編碼基因以外的角度重新注釋和闡明基因組的結構與功能，深入發現 生命活動的本質和規律，還有望從一個新的視角認識包括腫瘤在內的多種人類常見疾病的 發病機理，并為這些疾病的診斷與治療提供新的分子標志物與治療靶點。
[0004] 鼻咽癌是常見高發的頭頸部惡性腫瘤，容易發生頸部淋巴結轉移，預后較差。研 宄表明，這種腫瘤的發生發展是多基因參與、多步驟、多階段的復雜過程，LncRNA在鼻咽 癌的發生發展過程中可能也起到了重要的作用。最近我們利用IncRNA芯片，構建了鼻咽 癌活檢組織及正常對照樣品中IncRNA的表達譜，從中篩選了一些在鼻咽癌中差異表達的 IncRNAs，經擴大樣本實時熒光定量PCR驗證，證實IncRNA AFAP1-AS1 (NCBI accession number:NR_026892)在鼻咽癌中表達顯著上調，且AFAP1-AS1的表達水平與鼻咽癌的淋巴 結轉移及臨床分期密切相關，針對該IncRNA的檢測制劑也可以用于鼻咽癌的輔助診斷。隨 后，我們進一步增加樣本，在112例有臨床隨訪資料的鼻咽癌石蠟存檔標本中，通過原位雜 交（in situ hybridization)的方法檢測了 AFAP1-AS1的表達水平，發現AFAP1-AS1表達 高的患者更容易發生轉移，其生存時間短于該IncRNA表達低的患者，因此針對該IncRNA的 檢測制劑也可以用于鼻咽癌的預后判斷。
[0005] 我們通過設計并合成革E向AFAP1-AS1的短發夾RNA (short-hairpin RNA, shRNAs) 序列，構建了靶向AFAP1-AS1的RNA干擾載體，轉染到鼻咽癌細胞株中，在體外培養系統和 裸鼠轉移瘤體內模型中均證實靶向干擾AFAP1-AS1的表達可明顯抑制鼻咽癌細胞的侵襲 與轉移能力。將AFAP1-AS1的RNA干擾載體負載到多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒上制成納 米基因轉運體，多聚賴氨酸修飾的硅納米顆粒可保護AFAP1-AS1的RNA干擾載體免受核酸 酶降解，延長作用時間，且有更高的轉染效率。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的引物、檢測試劑及其應用，利用 AFAP1-AS1序列得到的引物可以制備用于鼻咽癌輔助診斷或者預后預測的制劑。長鏈非編 碼RNA AFAP1-AS1的應用方法，用于制備鼻咽癌輔助診斷或者療效預測的實時熒光定量檢 測試劑，該長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的序列如SEQ NO: 1所示。
[0007] 所述的實時熒光定量檢測試劑中包含：
[0008] 用于實時熒光定量檢測AFAP1-AS1表達的引物序列：
[0009] 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，
[0010] 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。
[0011] 所述的實時熒光定量檢測制劑為試劑盒。
[0012] 試劑盒中含有：
[0013] 用于實時熒光定量檢測AFAP1-AS1表達的引物序列：
[0014] 正向引物：5 ' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3 '，
[0015] 反向引物：5 ' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3 '。
[0016] 內參基因 GAPDH特異性PCR引物：
[0017] 正向引物 5 ' -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 '
[0018] 反向引物 5 ' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '。
[0019] 試劑盒中還含有：
[0020] (1)從鼻咽癌組織中抽提總RNA所用試劑，包括RNA穩定溶液、Trizol試劑、三氯 甲烷、異丙醇、無酶水；
[0021] (2)以總RNA為模板將LncRNA AFAP1-AS1逆轉錄為cDNA所用試劑，包括逆轉錄緩 沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸、RNA酶抑制劑、MMLV逆轉錄酶以及隨機引物；
[0022] (3)將cDNA實時定量PCR所用試劑，包括實時熒光定量SYBR染料、無酶水。
[0023] 我們從鼻咽癌和正常鼻咽上皮組織樣本中抽提RNA后逆轉錄，實時熒光定量法檢 測了 AFAP1-AS1的表達，結果顯示AFAP1-AS1在鼻咽癌組織中表達上調。提示AFAP1-AS1 可作為鼻咽癌預后預測的分子標志。本發明為鼻咽癌的輔助診斷和預后預測提供了強有力 的分子生物學工具，具有深遠的臨床意義和重要的推廣應用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實時熒光定量PCR技術驗證IncRNA AFAP1-AS1在鼻咽癌和正常鼻咽上皮 中的表達情況；
[0025] AFAP1-AS1在鼻咽癌（NPC)中的表達比正常鼻咽上皮（Normal)中顯著提高，且與 淋巴結轉移（左）及臨床分期（右）密切相關，AFAP1-AS1的表達在有淋巴結轉移的鼻咽 癌組織（NPC_Nl/2)中比沒有淋巴結轉移（NPC_N0)的更高（左圖），AFAP1-AS1的表達也隨 鼻咽癌患者臨床分期逐漸增高（右圖，I、II、III分別代表臨床I、II、III期）。
[0026] 圖2為原位雜交檢測AFAP1-AS1在鼻咽癌及正常鼻咽上皮中的表達情況；
[0027] 正常鼻咽上皮（NPE)中表達水平較低（僅在2例正常鼻咽上皮組織中檢測到有低 表達，其余8例中檢測不到表達），而在69. 64%的鼻咽癌（112例鼻咽癌組織中的78例） 中檢測到有AFAP1-AS1的表達，其中55例為低表達（NPC_Low)，23例為高表達（NPC_High)， 其余的34例鼻咽癌組織中未檢測到AFAP1-AS1的表達（NPC_negative) ;P〈0. 001。
[0028] 圖3為鼻咽癌中AFAP1-AS1的表達與鼻咽癌患者預后的關系
[0029] 鼻咽癌中AFAP1-AS1的高表達與鼻咽癌患者的不良預后相關，即AFAP1-AS1高 表達的患者總的生存時間（Over-all survival，左）和無復發生存時間（Relapse-free sruvival，右）要明顯低于AFAP1-AS1低表達或不表達的患者。
[0030] 圖4為在鼻咽癌細胞中導入AFAP1-AS1的干擾載體，可顯著抑制AFAP1-AS1在鼻 咽癌細胞中的表達
[0031] 在鼻咽癌細胞系5-8F、HKl和HNE2中導入靶向AFAP1-AS1的干擾載體（sh-1， sh-2, sh-3)后，實時熒光定量PCR方法檢測了鼻咽癌細胞中AFAP1-AS1的表達情況， AFAP1-AS1的表達均受到明顯的抑制。陰性對照（NC)為scramble干擾載體，Mock為未經 任何處理的鼻咽癌細胞。
[0032] 圖5為在鼻咽癌細胞中導入AFAP1-AS1的干擾載體抑制AFAP1-AS1表達后，細胞 侵襲能力降低
[0033] 細胞穿膜（transwell)實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HKl和HNE2中轉入靶向 AFAP1-AS1的干擾載體，抑制AFAP1-AS1的表達后，能穿過基質膠膜的鼻咽癌細胞數目顯著 減少，表明細胞侵襲能力降低。
[0034] 圖6為在鼻咽癌細胞中導入AFAP1-AS1的干擾載體抑制AFAP1-AS1表達后，細胞 迀移能力降低
[0035] 細胞劃痕實驗證實，在鼻咽癌細胞系5-8F、HKl和HNE2中轉入靶向AFAP1-AS1的 干擾載體，抑制AFAP1-AS1的表達后，鼻咽癌細胞從劃痕兩邊往劃痕中央迀移速度明顯減 慢，劃痕愈合的時間延長，表明細胞運動迀移能力降低。
[0036] 圖7.動物實驗進一步證實干擾AFAP1-AS1的表達可抑制鼻咽癌細胞的轉移能力
[0037] 在鼻咽癌細胞5-8F中轉入shRNA干擾載體抑制AFAP1-AS1表達后，經尾靜脈 將鼻咽癌細胞注射到裸鼠體內，觀察肺轉移情況，發現與對照組（NC)相比，shRNA敲低 AFAP1-AS1表達的5-8F細胞肺轉移灶的數目變少（圖7A-C，P〈0. 05)，轉移灶的體積變小 (圖7D)，表明鼻咽癌細胞的轉移能力受到明顯抑制。
【具體實施方式】
[0038] 以下結合【具體實施方式】進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0039] 實施例1，實時熒光定量PCR法檢測證實AFAP1-AS1在鼻咽癌中表達上調
[0040] 1.材料與方法：
[0041] 收集10例正常鼻咽上皮組織和31例鼻咽癌組織，抽提總RNA，2 μ g RNA經逆轉錄 成cDNA后，進行實時熒光定量PCR。AFAP-ASl正向引物為5' -AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3' 如 SEQ N0:8 所示，和反向引物 5' -CACACAGGGGAATGAAGAGG-3' 如 SEQ N0:9 所示。
[0042] 用于對照的 GAPDH 正向引物為 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'如 SEQ NO: 10 所示， 和反向引物 5' -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，如 SEQ N0:11 所示。
[0043] 實時熒光定量PCR反應體系
[0044] SYBR? Prcmix Ex Taq1 v, (2x) 1 ΟμΙ PCR Forward Primer ( 1 Ομη?) 0.4μΙ PCR Reverse Primer ( ΙΟμητ) 0.4μ1 cDNA 模板 2.0μ1 dH20 7·2μΙ Total 20μ1
[0045] 實時熒光定量PCR反應步驟
[0046] 1 94 C 5 min 2 951C IOsec 3 5