一種鑒定實蠅種類的集成流路芯片及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域,具體涉及一種鑒定實蠅種類的集成流路芯片及其應 用。
【背景技術】
[0002] 實幡(Fruit Flies)屬雙翅目(Diptera)實幡科(Tephritidae),全世界廣泛分 布,多發生在熱帶和亞熱帶地區。實蠅科約有500屬4500種,具有重要經濟意義的實蠅達 250余種,有些實蠅對水果生產會造成毀滅性災害。世界上具有經濟重要性的實蠅主要有5 個屬,分別是按實幡屬(Anastrepha)、果實幡屬(Bactrocera)、小條實幡屬(Ceratitis)、 寡鬃實幡屬(Dacus)和繞實幡屬(Rhagoletis)。
[0003] 在我國現行的進境植物檢疫性有害生物名錄中,檢疫性實蠅包含按實蠅屬、果實 蠅屬、小條實蠅屬、寡鬃實蠅(非中國種)、繞實蠅(非中國種)、歐非棗實蠅、棗實蠅、橘實 錘腹實蠅、甜瓜迷實蠅及番木瓜長尾實蠅等10個種屬;全國農業檢疫性實蠅及林業檢疫性 實蠅分別各有1個種,即蜜柑大實蠅和棗實蠅;在農業部發布的國家重點管理外來入侵物 種名錄中,包括3種實蠅類害蟲,分別為橘小實蠅、瓜實蠅和棗實蠅。
[0004] 由于口岸截獲的實蠅多為形態上難以區分的非成蟲態,一般需經1-2周飼養為成 蟲后才能被準確鑒定,極大降低了檢疫工作的時效性。傳統的實蠅鑒定工作主要依靠形態 學特征,但由于實蠅種類多,區分不同實蠅種類之間的形態學差別往往非常細微和復雜,有 的種類還需借助分布和寄主信息才能區分,有的種類的分類地位仍較為混亂,且實蠅新屬 和新種的描述還在不斷增加,特別是一些復合體種類的分類還存在爭議,這些問題的存在 都給實蠅傳統形態鑒定帶來了極大的阻礙。隨著國際果蔬貿易的發展,實蠅類害蟲傳入我 國的風險顯著增加,其檢疫鑒定特別是快速鑒定的需求愈發迫切。
[0005] 集成流路(Integrated Fluidic Circuit,IFC)芯片是一種利用具有高彈性的聚 二甲基硅氧烷材料,采用多層軟刻蝕技術在芯片上設計并加工成高密度的微泵微閥結構, 通過控制微泵微閥的關閉和開啟,快速準確地將反應液分成若干獨立的納升量級反應單 元,實現多步平行進行的通量高、體積小的PCR反應平臺。
[0006] 集成流體通路技術自出現以來,受到了科學界的格外青睞,該領域內的全球各大 公司也相繼推出了商業化產品。2006年,美國Fluidigm公司率先推出基于IFC技術的 BioMark?基因分析系統,該系統是集成IFC技術、Real-Time PCR技術和基因分析軟件相結 合的技術平臺,由BioMark? Real-Time PCR系統、IFC芯片、IFC控制器和數據分析軟件4 部分構成。其中,48. 48IFC動態芯片可同時進行2304個實時熒光PCR反應。
[0007] 目前,以IFC芯片為反應平臺的多種PCR技術已在醫學診斷、基因分型、單細胞基 因表達、轉基因檢測、環境微生物檢測、下一代測序等方面得到了廣泛的應用,但其在昆蟲 分子鑒定方面的應用未見報道。
【發明內容】
[0008] 本發明的一個目的是提供一種用于鑒定實蠅種類的成套引物和探針。
[0009] 本發明提供的用于鑒定實蠅種類的成套引物和探針由27個引物探針組組成。
[0010] 上述成套引物和探針中,
[0011] 所述引物探針組1為SEQ ID No. 1所示的引物I-USEQ ID No. 2所示的引物1-2 和SEQ ID No. 3所示的探針1組成;
[0012] 所述引物探針組2為SEQ ID No. 4所示的引物2-l、SEQ ID No. 5所示的引物2-2 和SEQ ID No. 6所示的探針2組成;
[0013] 所述引物探針組3為SEQ ID No. 7所示的引物3-l、SEQ ID No. 8所示的引物3-2 和SEQ ID No. 9所示的探針3組成;
[0014] 所述引物探針組4為SEQ ID No. 10所示的引物4-1、SEQ ID No. 11所示的引物 4- 2和SEQ ID No. 12所示的探針4組成;
[0015] 所述引物探針組5為SEQ ID No. 13所示的引物5-1、SEQ ID No. 14所示的引物 5- 2和SEQ ID No. 15所示的探針5組成;
[0016] 所述引物探針組6為SEQ ID No. 16所示的引物6-1、SEQ ID No. 17所示的引物 6- 2和SEQ ID No. 18所示的探針6組成;
[0017] 所述引物探針組7為SEQ ID No. 19所示的引物7-1、SEQ ID No. 20所示的引物 7- 2和SEQ ID No. 21所示的探針7組成;
[0018] 所述引物探針組8為SEQ ID No. 22所示的引物8-1、SEQ ID No. 23所示的引物 8- 2和SEQ ID No. 24所示的探針8組成;
[0019] 所述引物探針組9為SEQ ID No. 25所示的引物9-1、SEQ ID No. 26所示的引物 9- 2和SEQ ID No. 27所示的探針9組成;
[0020] 所述引物探針組10為SEQ ID No. 28所示的引物IO-USEQ ID No. 29所示的引物 10- 2和SEQ ID No. 30所示的探針10組成;
[0021] 所述引物探針組11為SEQ ID No. 31所示的引物Il-USEQ ID No. 32所示的引物 11- 2和SEQ ID No. 33所示的探針11組成;
[0022] 所述引物探針組12為SEQ ID No. 34所示的引物12-1、SEQ ID No. 35所示的引物 12- 2和SEQ ID No. 36所示的探針12組成;
[0023] 所述引物探針組13為SEQ ID No. 37所示的引物13-1、SEQ ID No. 38所示的引物 13- 2和SEQ ID No. 39所示的探針13組成;
[0024] 所述引物探針組14為SEQ ID No. 40所示的引物14-1、SEQ ID No. 41所示的引物 14- 2和SEQ ID No. 42所示的探針14組成;
[0025] 所述引物探針組15為SEQ ID No. 43所示的引物15-1、SEQ ID No. 44所示的引物 15- 2和SEQ ID No. 45所示的探針15組成;
[0026] 所述引物探針組16為SEQ ID No. 46所示的引物16-1、SEQ ID No. 47所示的引物 16- 2和SEQ ID No. 48所示的探針16組成;
[0027] 所述引物探針組17為SEQ ID No. 49所示的引物17-1、SEQ ID No. 50所示的引物 17- 2和SEQ ID No. 51所示的探針17組成;
[0028] 所述引物探針組18為SEQ ID No. 52所示的引物18-1、SEQ ID No. 53所示的引物 18- 2和SEQ ID No. 54所示的探針18組成;
[0029] 所述引物探針組19為SEQ ID No. 55所示的引物19-1、SEQ ID No. 56所示的引物 19- 2和SEQ ID No. 57所示的探針19組成;
[0030] 所述引物探針組20為SEQ ID No. 58所示的引物20-l、SEQ ID No. 59所示的引物 20- 2和SEQ ID No. 60所示的探針20組成;
[0031] 所述引物探針組21為SEQ ID No. 61所示的引物21-1、SEQ ID No. 62所示的引物 21- 2和SEQ ID No. 63所示的探針21組成;
[0032] 所述引物探針組22為SEQ ID No. 64所示的引物22-l、SEQ ID No. 65所示的引物 22- 2和SEQ ID No. 66所示的探針22組成;
[0033] 所述引物探針組23為SEQ ID No. 67所示的引物23-l、SEQ ID No. 68所示的引物 23- 2和SEQ ID No. 69所示的探針23組成;
[0034] 所述引物探針組24為SEQ ID No. 70所示的引物24-l、SEQ ID No. 71所示的引物 24- 2和SEQ ID No. 72所示的探針24組成;
[0035] 所述引物探針組25為SEQ ID No. 73所示的引物25-l、SEQ ID No. 74所示的引物 25- 2和SEQ ID No. 75所示的探針25組成;
[0036] 所述引物探針組26為SEQ ID No. 76所示的引物26-l、SEQ ID No. 77所示的引物 26- 2和SEQ ID No. 78所示的探針26組成;
[0037] 所述引物探針組27為SEQ ID No. 79所示的引物27-l、SEQ ID No. 80所示的引物 27- 2和SEQ ID No. 81所示的探針27組成。
[0038] 上述成套引物和探針中,所述引物探針組中的引物與探針的物質的量比為9 :20。
[0039] 上述成套引物和探針中,所述實蠅種類為如下27種中任一種:墨西哥按實蠅、西 印度按實蠅、蒲桃果實蠅、番石榴果實蠅、楊桃果實蠅、橘小實蠅、辣椒果實蠅、銹紅果實蠅、 昆士蘭果實蠅、短尾果實蠅、面包果實蠅、桃果實蠅、油橄欖果實蠅、橘大實蠅、蜜柑大實蠅、 萌瓜實蠅、兩帶果實蠅、瓜實蠅、寬帶果實蠅、南亞果實蠅、棗實蠅、地中海實蠅、芒果小條實 蠅、納塔耳小條實蠅、萌蘆寡鬃實蠅、櫻桃繞實蠅和蘋繞實蠅。
[0040] 本發明的另一個目的是提供一種用于鑒定實蠅種類的PCR試劑。
[0041] 本發明提供的用于鑒定實蠅種類的PCR試劑由PCR試劑1、PCR試劑2、PCR試劑 3、PCR試劑4、PCR試劑5、PCR試劑6、PCR試劑7、PCR試劑8、PCR試劑9、PCR試劑10、PCR 試劑11、PCR試劑12、PCR試劑13、PCR試劑14、PCR試劑15、PCR試劑16、PCR試劑17、PCR 試劑18、PCR試劑19、PCR試劑20、PCR試劑21、PCR試劑22、PCR試劑23、PCR試劑24、PCR 試劑25、PCR試劑26和PCR試劑27組成;
[0042] 所述PCR試劑1包括上述成套引物和探針中的引物探針組1 ;
[0043] 所述PCR試劑2包括上述成套引物和探針中的引物探針組2 ;
[0044] 所述PCR試劑3包括上述成套引物和探針中的引物探針組3 ;
[0045] 所述PCR試劑4包括上述成套引物和探針中的引物探針組4 ;
[0046] 所述PCR試劑5