一種酵母短肽與酵母細胞壁多糖的同步制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及制備方法，特別涉及一種酵母短肽與酵母細胞壁多糖的同步制備方法。
【背景技術】
[0002]釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一種含有豐富營養物質的工業副產物，含有50%左右的蛋白質，人體必需的八種氨基酸含量均很高。釀酒酵母細胞壁中含有25%?35%的多糖，主要為β-葡聚糖(約29% )和甘露聚糖(約31% ) (Bacon et al，1969 ；Fleet et al，1976 ；Kath et al，1999)，其中，β -葡聚糖的主要生理功能是維持細胞壁的結構，保持細胞正常的生理形態；而甘露聚糖則主要負責細胞識別和與環境的交互作用，決定酵母的免疫特性(Ruiz-Herrera，1992)。
[0003]酵母蛋白氨基酸比例協調，用蛋白酶酶解酵母蛋白可以獲得具有高生物活性的短肽制品；β -葡聚糖位于細胞壁的最內層，而甘露聚糖存在于酵母細胞壁外層，二者通過蛋白質連接構成酵母細胞壁的基本組成。葡聚糖由β-1，3-葡聚糖和β-1，6-葡聚糖組成(葡萄糖殘基通過β-1，3-糖苷鍵和β-1，6-糖苷鍵組成(劉紅芝等，2006)，兩者比例為85:15，以β-1，3-糖苷鍵為骨架，β-1，6-糖苷鍵為支鏈，并且β-1，6-葡聚糖的還原端連接到β -1, 3-葡聚糖非還原端的末端葡萄糖上，在氫鍵作用下共同形成一個三維網絡結構；甘露聚糖相對分子質量主要分布在20000?200000(劉紅芝等，2008)間，由α -甘露糖以α-1，6糖苷鍵形成主鏈，并聯結以α_1，2糖苷鍵和α _1，3糖苷鍵連接的數目不等的甘露糖側鏈(Cabib et al，1982)，其中一些側鏈結合有一些可能是酵母細胞抗原決定部位的基團，并且甘露聚糖攜帶一個分子量大概為10kDa的蛋白。
[0004]釀酒酵母短肽的制備方法主要采用酸水解法、堿水解法和酶法等。其中，蛋白質酸水解會造成某些氨基酸的損失，產生的蛋白質衍生物包含非天然結構，或不能被人體代謝，甚至可能產生抑制作用和毒性；而蛋白質經堿水解處理，會導致其中的氨基酸發生消旋作用，使必需氨基酸的L-對映體減少和消化率降低，并產生有毒的D-氨基酸。而酶法制備釀酒酵母短肽主要采用堿性蛋白酶，其在調節PH的過程會大量引入鹽離子，影響產品純度；為提高產品純度需對肽產品進行脫鹽處理，操作周期長且需要增加設備投入。
[0005]酵母細胞壁甘露聚糖的分離提取方法包括酸法、堿法、酶法及熱水浸提法等。其中，酸法會導致所得產品的蛋白含量較高，且甘露聚糖在酸性條件下容易發生水解；堿法使用大量堿液，既會導致甘露聚糖降解又會污染環境；酶法提取所得產品的蛋白含量較高，純度較低，需進一步純化處理；熱水浸提所得產品的純度較低，如果在浸提過程中加入氯化鈉，會導致產品鹽離子含量升高。
[0006]釀酒酵母細胞壁β -葡聚糖的制備方法主要有物理法(如超聲)、化學法(如酸法、堿法和酸堿法)和生物法(如酶法)。其中，物理法所得產品純度較低，需要與其他方法結合以提高純度；化學法需要大量使用酸堿，所得產品純度較低，且會對葡聚糖的結構造成損失，進而破壞其生理活性；而由于生物方法作用手段溫和，需要與其它方法結合使用來提高所制備的酵母葡聚糖的純度。
[0007]酵母短肽因很好地保留了啤酒酵母原有的營養和功能成分，可作為功能性保健品原料而用于食品、醫藥及飼料行業。β -葡聚糖和甘露聚糖作為主要的酵母細胞壁多糖具有多種功能活性，如免疫增強功能、抗輻射和抗氧化功能以及霉菌吸附功能。發明一種酵母細胞短肽與細胞壁多糖的綠色同步制備技術，不僅可以充分利用我國的酵母資源，還可以進一步開發具備高功能活性的酵母短肽和多糖產品。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種酵母短肽與酵母細胞壁多糖的同步制備方法。
[0009]為達到上述目的，具體采用如下的技術方案:
[0010]一種酵母短肽與酵母細胞壁多糖的同步制備方法，包括如下步驟:
[0011](I)將釀酒酵母加入去離子水中得到懸浮液，向所述懸浮液中加入中性蛋白酶進行酶解自溶，滅酶活后離心，得到上清a和沉淀a ;
[0012](2)將所述上清a經干燥后，即得酵母短肽；
[0013](3)向所述沉淀a中加入去離子水進行離心清洗得沉淀al，然后向沉淀al中加入去離子水得到懸浮液，所述懸浮液抽提后離心，得到上清b和沉淀b ;
[0014](4)將所述上清b濃縮，向所述濃縮后的上清b中加入乙醇進行醇沉，離心后得沉淀，所述沉淀經干燥后即得酵母細胞壁甘露聚糖；
[0015](5)向所述沉淀b中加入去離子水得到懸浮液，將所述懸浮液高速分散，將經高速分散后的懸浮液進行酶解處理，滅酶后得酶解液，然后進行高壓微射流處理，離心后得沉淀，所述沉淀采用無水乙醇脫水后，經干燥即得酵母細胞壁β -葡聚糖。
[0016]具體的，步驟⑴中，釀酒酵母與去離子水的體積比為1:4?6。
[0017]為了充分酶解釀酒酵母細胞得到細胞壁，步驟(I)中性蛋白酶的用量為200?300U/g，采用酶解進行誘導自溶時，酶解自溶的溫度為40?60°C，時間為20?30h，pH值為6.0?8.0 (優選為7.0) ο
[0018]具體的，所述中性蛋白酶選自Neutrase或/和Flavorzym。
[0019]步驟(3)的具體操作步驟為:向所述沉淀a中加入去離子水進行離心清洗得到沉淀al，然后按質量比1:3?10向沉淀al中加去離子水得到懸浮液，對所述懸浮液在90?100°C的條件下高溫抽提3?6h，抽提結束后進行離心處理，分別得上清b和沉淀b。
[0020]所述離心處理的離心轉速為4000?5000rpm，離心時間為10?20min ;優選地，離心轉速為4500rpm，離心時間為lOmin。
[0021]為了提高糖濃度，增強乙醇與糖的結合從而使糖完全沉淀，步驟(4)中，所述濃縮后的上清b為濃縮前上清b體積的1/5?1/3;步驟(4)中，所述加入乙醇進行醇沉的步驟為:先用體積分數為50%?75%的乙醇進行沉淀，采用去離子水復溶，復溶后再次使用60 %?80 %的乙醇進行沉淀。
[0022]為了徹底分散沉淀b，使其與酶充分反應，提高高壓微射流均質效果，步驟(5)的具體操作步驟為:按質量比1:4?6向所述沉淀b中加入去離子水得到懸浮液；采用高速分散器，在6000?8000rpm的條件下處理5?lOmin，得高速分散懸浮液，將所述高速分散懸浮液加入蝸牛酶或中性蛋白酶Neutrase進行酶解，酶的添加量為所述沉淀b質量的0.02%?0.05%，在35?55°C的條件下酶解I?3h，滅酶后得酶解液，所述酶解液在壓力100?200MPa和處理流量為20?200mL/min的條件下，高壓微射循環處理3?6次，離心后得沉淀，所述沉淀采用無水乙醇脫水后，經干燥即得酵母β -葡聚糖。
[0023]步驟⑷和步驟(5)干燥的溫度均為40?65°C。
[0024]本申請中滅酶活處理為本領域的常規技術手段，具體的，滅酶活的溫度可為90°C，時間為1min。
[0025]本發明提供的制備方法以釀酒酵母為原料，首先對酵母菌體多次離心洗凈，洗凈后的菌體分散調漿，進行酶解自溶，離心，取上清噴霧干燥制備酵母短肽，沉淀進行高溫抽提制備葡聚糖和甘露聚糖；高溫抽提后離心可以得到上清液和沉淀兩部分；上清液經過濃縮、醇沉、干燥得到甘露聚糖；下層沉淀經過高速分散、酶解和高壓微射流均質處理得到葡聚糖，本發明制得的產品純度高(短肽、葡聚糖、甘露聚糖的純度均大于90% )，所采用的制備條件溫和，不采用強酸、強堿和有機溶劑等對環境有害的試劑，且可實現產業化規模生產。而且本發明可實現工業副產物廢啤酒酵母的綜合利用，增加工業副產物的利用率和附加價值，具有重大的經濟效益和環保意義。
[0026]利用本發明的制備方法得到的產品方面具有以下優點:酵母細胞壁短肽具有抗氧化活性，在lmg/mL濃度時，DPPH清除率達49.94%。
[0027]酵母細胞壁葡聚糖具有增強免疫的功效，在150mg/kg.d劑量時可以顯著增強ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化率，吸光度值為0.68，是空白對照組的2.20倍；在150mg/kg.d劑量時，小鼠NK細胞的殺傷率為69.32%。
[0028]酵母細胞壁甘露聚糖具有增強免疫力、抑制腫瘤活性的功效。在50mg/kg.d劑量時可以顯著增強ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化率，吸光度值為0.76，是空白對照組的1.84倍，50mg/kg.d劑量時可以顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬功能，吞噬百分率為20.35%;具有直接抑制HL-60腫瘤細胞生長的作用，在1.58mg/mL時能夠抑制50%的HL-60腫瘤細胞。
【附圖說明】
[0029]圖1為酵母短肽與酵母細胞壁多糖的同步制備方法的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0030]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0031 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0033]下述實施例中的酵母細胞壁購自浙江深友生物技術有限公司。
[0034]實施例1:酵母多糖和短肽的制備
[0035]本實施例中酵母短肽與酵母細胞壁多糖的同步制備方法包括以下步驟:
[0036](I)釀酒酵母用去離子水洗滌后離心去除雜質，按體積比1:6加去離子水配制成懸浮液a，向所述懸浮液a中按加酶量200U/g加入中性蛋白酶Neutrase，置于pH7.0和55°C的條件下在恒溫去離子水浴振蕩器中酶解自溶20h，然后升溫至90°C，保溫1min滅酶，離心，分別得到上清a和沉淀a ；
[0037](2)采用噴霧干燥對步驟(I)中所得上清a進行干燥即得到酵母短肽；
[0038](3)向所述沉淀a中加入去離子水進行離心清洗得到沉淀al，然后按質量比1:6(沉淀al與去離子水的質量比為1:6)向沉淀al中加去離子水得到懸浮液，對所述懸浮液在90°C的條件下高溫抽提3.5h，離心，分別得上清b和沉淀b ;
[0039](4)對步驟(3)中所得上清b在70°C下進行3倍濃縮(即所述濃縮液后的體積為上清b的1/3)，所得到的濃縮液先用體積分數為50%的乙醇進行沉淀，采用去離子水復溶，然后使用75 %體積分數的乙醇醇沉得沉淀，將所述沉淀置于65 0C的鼓風干燥箱中烘干，粉碎即得到酵母甘露聚糖；
[0040](5)對步驟(3)中所得沉淀b用去離子水洗3次去除雜質，再以質量比1:6(沉淀b與去離子水的質量比為1:6)加去離子