一種靈芝發酵轉化大豆異黃酮糖苷制備苷元的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物轉化技術領域，尤其涉及一種靈芝發酵轉化大豆異黃酮糖苷制備 苷元的方法。
【背景技術】
[0002] 靈芝[Ganoderma lucidum(Leyss. ex. Fr. ) Karst]隸屬擔子菌亞門 (Basidiomycetes)、層菌綱（Hymenomycetes)、多孔菌目（Polyparales)、多孔菌科 (Polyporaceae)、靈芝屬（Ganoderma)，是一種藥用價值很高的食用菌，在我國已有2000多 年的歷史。《中國人民共和國藥典》（2000版）將靈芝補錄，明確指出靈芝具有"補氣安神， 止咳平喘"的功效，其所具有的較重要的藥理作用有抗腫瘤、抗放療與抗化療、抗心肌缺血、 調節血脂、免疫調節、抗缺氧、清除自由基及延緩衰老等，最近的研宄還顯示靈芝具有抑制 艾滋病毒增殖的效果。
[0003] 靈芝主要的活性成分有多糖類、三萜類、核苷類、留醇類、生物堿類、呋喃衍生物、 氨基酸多肽類、微量元素、脂肪酸、有機鍺等。其中，靈芝多糖和靈芝三萜是其主要的生物活 性成分。靈芝多糖主要的藥理作用有：抗腫瘤、免疫調節、抗氧自由基、活化淤血、抗衰老等。 靈芝三萜的主要藥理作用有：保肝、抗腫瘤、鎮痛、抑制血小板聚集等。
[0004] 大豆異黃酮（Soybean Isoflavone)是一類從大豆中提取出的具有多酷結構混合 物的統稱，是一類具有雌激素樣作用的具有營養學價值和治療意義的非固醇類物質，也是 最主要的"異黃酮"類植物雌激素之一。其主要成分有3種，即染料木黃酮（Genistein)、大 豆苷元（Daidzein)和大豆黃素（Glycitein)。通常情況下，這三種異黃酮母核與葡萄糖以 β -糖苷鍵連接，以異黃酮葡萄糖苷形式存在于大豆中，分別稱為染料木苷（Genistin)、大 豆苷（Daidzin)和6-甲氧基大豆苷（Glycitin)，含量占大豆異黃酮的97~98%。研宄發 現，大多數的結合型糖苷不能通過小腸壁，真正在體內被吸收而產生生理活性的是游離苷 元Gen和Den。大豆異黃酮除具有弱的雌激素活性外，還具有抗癌、抗氧化、抗溶血、抗真菌 等活性，同時能夠有效抑制白血病、骨質增生、乳腺癌、前列腺癌和結腸癌等多種疾病的發 生。
[0005] 一般情況下，大豆異黃酮苷元主要通過以下方式獲得：（1)堿水解，但水解得到的 大豆異黃酮苷元很不穩定，容易降解；（2)酸水解，一般所用的酸為鹽酸，水解效率雖然很 高，但強酸條件不易實現工業化，同時會使產品色澤、口感及滋氣味較差，影響產品品質； (3)酶水解，反應速度快，條件溫和，工藝參數容易控制，但酶制品成本高，而利用微生物發 酵的方法直接生產大豆異黃酮苷元可大幅降低成本。
[0006] 微生物轉化是利用生物代謝過程中產生的某個或某一系列的酶對底物進行催化 反應，具有反應條件溫和、操作性強、無環境污染等特點，同時微生物培養具有繁殖迅速，生 長周期短，可以降低成本，易于工業化生產。由于大豆異黃酮分子中糖基的連接鍵是β-糖 苷鍵，所以可以利用可分泌β-葡萄糖苷酶的微生物發酵來實現大豆異黃酮苷元的制備。 目前，曲霉被普遍認為是產β-葡萄糖苷酶的優良菌種，尤以黑曲霉的效率最高，但僅限于 實驗室研制階段，黑曲霉β -葡萄糖苷酶的轉化效率仍有待提高。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一種靈芝發酵轉化大豆異黃酮糖苷制備苷元的方法，該方法獲得的 β-葡萄糖苷酶的酶活高，產物大豆異黃酮糖苷元的轉化率高。
[0008] 一種靈芝發酵轉化大豆異黃酮制備苷元的方法，包括：
[0009] (1)將靈芝接入培養基進行發酵培養，獲得含靈芝菌絲體的發酵液；
[0010] (2)對發酵液進行勻漿處理，使靈芝菌絲體破碎，β-葡萄糖苷酶釋放到發酵液 中，獲得粗酶液；
[0011] (3)將粗酶液與大豆異黃酮糖苷混合，反應獲得大豆異黃酮苷元。
[0012] 對發酵液進行勻漿處理，即可破碎發酵液中的菌絲體，釋放β -葡萄糖苷酶；釋放 后無需提取β-葡萄糖苷酶即可直接用于大豆異黃酮糖苷的轉化，轉化后得到的大豆異黃 酮苷元包含染料木素（Genistein)、大豆苷元（Daidzein)和黃豆黃素（Glycitein)，其中， 黃豆黃素的含量極低，可以忽略。
[0013] 作為優選，以重量百分比計，所述培養基包括麥芽汁4. 10%，酵母浸出粉1.8%， KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，ρΗ5. 40。其中，糖化后的麥芽汁使用糖度儀測定其 含糖量，試驗中所涉及的麥芽汁的用量均以其溶液中的含糖量計，即4. 10%為麥芽汁的含 糖量。
[0014] 作為優選，所述發酵培養的條件為：25~30°C下培養6~8天。
[0015] 步驟（2)中，在0~5°C條件下進行勻漿處理，以避免β-葡萄糖苷酶酶活的降低。
[0016] 通過實驗對粗酶液與大豆異黃酮糖苷的反應條件以及粗酶液中葡萄糖苷酶 與大豆異黃酮糖苷的用量關系進行優選
[0017] 作為優選，步驟（3)中，反應的溫度為50°C~60°C ;更優選，60°C。
[0018] 步驟（3)中，反應的時間為6~60h;更優選，42h。步驟（3)中，反應液pH值為 4~6〇
[0019] 更優選，步驟（3)中，反應的溫度為60°C，反應的時間為42h，反應液pH值為4~ 6〇
[0020] 作為優選，以Ig大豆異黃酮糖苷計，粗酶液中β -葡萄糖苷酶的用量為10~30U。
[0021] 發酵培養前，將靈芝接入種子培養基中進行培養，培養條件為：28°C下培養8天。
[0022] 作為優選，以重量百分比計，所述種子培養基包括馬鈴薯1 %，葡萄糖2%，蛋白胨 1.8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%，VB10.00 5%，pH 5.5,121°C濕熱滅菌 20min，VB1 過濾除 菌。
[0023] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0024] (1)本發明通過深度發酵靈芝獲得大量β -葡萄糖苷酶轉化大豆異黃酮制備苷 元，獲得的β -葡萄糖苷酶的活性高，產物轉化率高，大大提高了大豆異黃酮的活性及吸收 率，同時轉化產物還富含靈芝胞外及菌絲體多糖等生物活性物質，為新型功能物質的開發 及工業化生產奠定基礎；
[0025] (2)靈芝液體深層發酵具有繁殖迅速，生長周期短等優點，可以降低成本，易于工 業化生產；
[0026] (3)采用靈芝的發酵產物轉化大豆異黃酮糖苷，具有反應條件溫和，工藝簡單、操 作性強、無有機溶劑殘留、無環境污染等特點。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發明靈芝菌株液體發酵過程中β -葡萄糖苷酶酶活變化；
[0028] 圖2為本發明大豆異黃酮添加量對靈芝轉化大豆異黃酮影響；
[0029] 圖3為本發明溫度對靈芝轉化大豆異黃酮影響；
[0030] 圖4為本發明轉化時間對靈芝轉化大豆異黃酮影響；
[0031] 圖5為本發明大豆異黃酮粗提物中大豆苷元、染料木素及其糖苷物質含量的示意 圖；
[0032] 圖6為本發明轉化產物中大豆苷元、染料木素及其糖苷物質含量的示意圖（轉化 條件：大豆異黃酮5g，60°C，48h)。
【具體實施方式】
[0033] 1、靈芝菌株的液體發酵培養方法
[0034] 各菌株培養保存于斜面培養基中，取4-5塊Icm2菌絲塊接種到種子液培養基，于 28°C，180rpm培養8d后得靈芝液體種子液。然后按10% (v/v)接種量將各種子液接種到 發酵培養基中，28°C，180rpm培養7d。
[0035] 斜面培養基：馬鈴薯 1%，葡萄糖 2%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. ISKVB10.00 5%，瓊脂 2%，121°C濕熱滅菌20min，VB1過濾除菌。
[0036] 種子液培養基：馬鈴薯1%，葡萄糖2%，蛋白胨1.8%，KH2P040. 3%，MgS040. 15%， VB10.00 5%，pH 5· 5,121°C 濕熱滅菌 20min，VB1 過濾除菌。
[0037] 液體發酵培養基：麥芽汁4. 10%，酵母浸出粉1. 8%，KH2PO4O. 3%，MgSO4O. 15%， VB10.00 5%, pH5. 40〇
[0038] 麥芽汁的制備：取啤酒制備所用小麥芽，按照European Brewery Cenvention(EBC)方法制備麥芽汁，利用手持糖度折光儀測定麥芽汁含糖量，后續實驗均以 含糖量（％ )計。
[0039] 2、β -葡萄糖苷酶活力測定方法
[0040] 葡萄糖苷酶活力單位（U)定義為，在pH 5.0, 50°C反應條件下，一分鐘時間內 底物被水解釋放出1 μ mol的pNP所需要的酶量。
[0041] pH5. 0 的 P-C 緩沖液：稱取 Na2HPO4 · 12H20 3. 689g、檸檬酸 1.0 lg 溶于 100mL 蒸餾 水中，調pH至5.0并定容。
[0042] 底物（pNPG)工作液：準確稱取pNPG 150. 65mg，完全溶解于100ml pH5. 0的P-C緩 沖液中備用。
[0043] β -葡萄糖苷酶酶活測定：離心收集靈芝液體發酵菌絲，加入適量蒸餾水后超聲 破碎，4°C下 1000 Og 離心 15min，取 100μΙ 上清與 200 μ1 5mM pNPG 混勻，50°C保溫 30min， 加入2ml lmol/L Na2CO3*止反應并顯色，于400nm下測定吸光值。
[0044] β -葡萄糖苷酶酶活（U/g) = (x