一種轉谷酰胺酶交聯大豆分離蛋白保護乳桿菌的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用轉谷酰氨酶交聯技術所形成的大豆分離蛋白凝膠對乳桿菌 進行保護的方法。
【背景技術】
[0002] 乳桿菌是在發酵食品和益生菌制品生產中經常使用的菌株，也是哺乳動物腸道內 的有益微生物，主要的益生作用包括：平衡腸道菌群、改善腸道功能、控制血清膽固醇水平、 防止腹瀉、抗癌等。
[0003] 但在乳桿菌的應用和食用過程中會遭遇各種脅迫，例如酸奶體系中的酸脅迫，腌 制品中的鹽脅迫，儲藏過程中的冷脅迫，益生菌進入胃腸道將會遭受到膽鹽、酸、消化酶的 影響等，這些脅迫環境會導致乳桿菌活菌數下降，進而影響乳桿菌的發酵和益生性能。為了 確保益生菌在人體充分發揮益生作用，幾個國際組織已經頒布了某些益生菌最小活菌數的 標準，他們要求在出售的發酵乳中，嗜酸乳桿菌最小活菌數應達到10 7cfU/mL，雙歧桿菌應 達到106cfu/mL。在日本，發酵乳和乳飲料協會要求在發酵乳飲品中雙歧桿菌活菌數至少要 達到 107cfu/mL。
[0004] 微膠囊（microencapsule)是一種能包埋和保護某些敏感性物質的具有聚合物壁 殼的半透性的微型"容器"或"包裝物"。通過特殊的方法，利用天然或合成的高分子材料包 覆固體、液體甚至是氣體物質，制成有囊壁的微型膠囊以及保留或截留其它物質的微粒，從 而達到保護、控釋等效果，這一過程稱為微膠囊化（microencapsulation)。微膠囊化的目的 是建立一個微環境，在這里敏感的活性物質可以在加工和貯存過程中更好的存活下來，然 后在消化道中適當位點（例如小腸）被釋放出來。有研宄發現，在加工、貯存過程中，或者當 乳桿菌在人體胃腸道中傳遞時，微膠囊能夠起到保護乳桿菌的作用。因為微膠囊能削弱低 PH胃酸、膽鹽等脅迫環境對益生菌的傷害，同樣在液態產品，如乳制品中也有同樣的作用。
[0005] 通常，在以海藻酸等多糖凝膠為微膠囊化的壁材時，常會用到CaC12、甲醛、戊二醛 這樣的化學交聯劑或醛類固化劑，殘留的化學交聯大分子會存在毒性，嚴重限制了微膠囊 產品在食品中的應用。而轉谷氨酰胺酶作為一種無毒的酶類可以催化多種蛋白形成水不 溶性的凝膠，替代常用的多糖凝膠，避免引入有毒的交聯劑，擴大微膠囊在食品領域中的應 用。將乳桿菌微膠囊制備成粉末狀可以使食品中的乳桿菌在加工、運輸、貯存和食用之前保 持較高存活率。常用的干燥方法有噴霧干燥法和真空冷凍干燥法，因為乳桿菌對溫度比較 敏感，所以通過真空冷凍干燥法制備微膠囊粉末，更有利于保持較高的存活率。因此利用轉 谷氨酰胺酶交聯大豆分離蛋白，并利用真空冷凍干燥技術制備乳桿菌微膠囊，勢必推動微 膠囊領域的變革，為益生菌微膠囊的開發與應用提供一個新的途徑。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種轉谷酰胺酶交聯大豆分離蛋白保護乳桿菌的方法，通過 研宄微膠囊中乳桿菌的凍干存活率，確定達到最好保護作用的轉谷酰胺酶交聯大豆分離蛋 白的條件；對結構特性的研宄，揭示交聯處理會加強保護性的原因；通過在模擬胃液和模 擬腸液中存活率的分析，確定微膠囊化后抗性提高；通過貯存穩定性和在酸奶中的應用實 驗，進一步驗證其在發酵食品中應用的可行性。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0008] 一種轉谷酰胺酶交聯大豆分離蛋白保護乳桿菌的方法，包括以下步驟：
[0009] 一、采用滅菌蒸餾水配制4~10% (w/w)的大豆分離蛋白溶液，以0. 3~2mol/L HCl (HC1使用0· 22 μ m濾膜過濾除菌）調節蛋白質溶液pH為6. 5~8. 0 ;
[0010] 二、按照10~40U/g蛋白質的濃度加入轉谷氨酰胺酶（TGase)，使用磁力攪拌器攪 拌均勻，在30~50°C交聯1~4h，然后立即使用冰水浴冷卻，之后放入2~8°C冰箱貯存備 用。
[0011] 三、向經交聯處理的大豆分離蛋白溶液中加入5~15倍乳桿菌濃縮液，其加入量 為經交聯處理的大豆分離蛋白溶液的5~15% (w/w)，攪拌5~15min混合均勾后，再經冷 凍干燥制備微膠囊，得到微膠囊化效率為67. 4±2. 7%。
[0012] 本發明中，所述的冷凍干燥是將乳桿菌與交聯處理后獲得的蛋白質溶液混合均勻 后先在-15~-25°c預凍7~12h，然后真空冷凍干燥8~17h。
[0013] 本發明具有如下優點：
[0014] 1、本發明利用轉谷酰胺酶交聯大豆分離蛋白形成的凝膠對乳桿菌進行保護。
[0015] 2、本發明拓展了凝膠制品的應用領域，尤其是在生物活性物質領域的應用。
[0016] 3、本發明所獲得的利用轉谷酰胺酶交聯大豆分離蛋白包埋乳桿菌制備的鼠李糖 乳桿菌微膠囊在PH2. 5和pH3. 5的模擬胃液中作用2h后的存活率分別為5. 25±0. 50% 和12. 38±0. 62%，顯著高于未經TGase交聯的對照組（P < 0. 01)(分別為1.04±0. 07% 和2. 87±0. 38% )。鼠李糖乳桿菌微膠囊在含有0. 3%和2%膽鹽的模擬腸液中作用4h 后的存活率分別為13. 82±0. 72%和4. 43±0. 50%，顯著高于未經TGase交聯的對照組（P < 0· 01)(分別為 4. 21±0· 53%和 0· 92±0· 06% )。
[0017] 4、本發明含有乳桿菌的微膠囊具有良好的儲存穩定性，適用于在發酵食品等中 的應用。鼠李糖乳桿菌微膠囊經真空包裝后在4°C條件下貯藏21d后，發現鼠李糖乳桿菌 活菌數下降1.00Logl0(cfu/g)，存活率為10. 04±0. 50%。37°C條件下貯藏21d后，LGG 活菌數下降1.8禮呢10((^11/^)，存活率為1.30±0.04%。顯著高于未經了6&%交聯的對 照組（P < 0.05)(存活率分別為：1.42±0. 12%和0. 17±0.01% )。將鼠李糖乳桿菌微 膠囊應用于酸奶，在4°C下儲存21d后，鼠李糖乳桿菌活菌數僅下降0. 73LoglO (cfu/g)， 存活率為14. 49±0. 53 %，極顯著高于未經TGase交聯的對照組（P < 0. 01)(存活率為 2. 65±0· 46% )。
[0018] 5、本發明進一步推廣了大豆分離蛋白凝膠和乳桿菌的實際應用，進而可以更好的 保護活乳桿菌的數量，為微膠囊化乳桿菌的工業化生產奠定基礎。
【附圖說明】
[0019] 圖1為不同TGase添加量制備的微膠囊的微膠囊化效率和未經交聯凍干粉末中 LGG存活率；
[0020] 圖2為不同交聯時間制備的微膠囊的微膠囊化效率和未經交聯凍干粉末中LGG存 活率；
[0021] 圖3為不同交聯溫度制備的微膠囊的微膠囊化效率和未經交聯凍干粉末中LGG存 活率；
[0022] 圖4為不同交聯pH制備的微膠囊的微膠囊化效率和未經交聯的凍干粉末中LGG 存活率；
[0023] 圖5為微膠囊化和未微膠囊化的LGG在模擬胃液中的存活率；
[0024] 圖6為微膠囊化和未微膠囊化的LGG在模擬腸液中的存活率；
[0025] 圖7為微膠囊和未微膠囊化粉末在4°C條件下貯存的LGG存活率；
[0026] 圖8為微膠囊和未微膠囊化粉末在37°C條件下貯存的LGG存活率；
[0027] 圖9為酸奶貯存期間LGG的存活率。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，凡是對本 發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，均應涵蓋 在本發明的保護范圍中。
[0029] 實施例1
[0030] 濃縮菌懸液的制備：
[0031] 將鼠李糖乳桿菌LGG培養液加入到離心管中，在4°C條件下，6000r/min離心15min 棄上清。菌泥用等體積生理鹽水（0. 9% NaCl溶液）在相同離心條件下洗滌兩次，用原菌液 1/10體積的生理鹽水重新懸浮菌泥，得到十倍濃縮菌懸液。
[0032] 實施例2
[0033] LGG微膠囊制備條件的優化
[0034] 通過單因素和響應面試驗確定最佳酶添加量、交聯時間、交聯溫度、交聯pH。
[0035] 單因素試驗結果見圖1-4,響應面試驗設計及結果見表1，回歸模型進行方差和顯 著性檢驗分析見表2。
[0036] 表 1
[0037]
[0038] 表 2
[0039]
[0040] 結論：利用D