一型硫氧還蛋白在內皮祖細胞的培養中的應用及內皮祖細胞的培養方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及細胞培養領域，尤其涉及一型硫氧還蛋白在內皮祖細胞的培養中的應 用及內皮祖細胞的培養方法。
【背景技術】
[0002] 目前，構建組織工程化血管所用內皮種子細胞多是從成年動物或人體大血管消化 得到的成熟內皮細胞，這不僅造成新的機體創傷，而且該來源的內皮細胞在體外培養過程 中，細胞擴增量和細胞活性均不理想，很難達到預期的效果。因此急需一種增殖能力和活性 俱佳的血管內皮細胞來作為種子細胞。
[0003] 內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs)，是血管內皮細胞的前體細 胞，是⑶34陽性細胞的一個亞群。1997年有文獻報道在體外成功地將⑶34陽性細胞誘導 成血管內皮細胞，說明在成人體內存在內皮祖細胞。后有多篇報道證實，由EPCs分化而來 的內皮細胞能夠參與實體腫瘤血管化，心肌局部缺血以及肢體局部缺血側枝循環的建立。 因此，EPCs有望成為血管組織工程內皮種子細胞的一個新來源。
[0004] 然而，現有技術對EPCs的培養效果大多不甚理想，普遍存在著一些問題導致EPCs 無法再體外穩定的增殖，例如：增殖天數有限（通常在12天內）、傳代次數有限（通常在P6 代以內）、增殖倍數不高（通常在50倍以下）、容易老化（細胞培養時間越長，細胞表面標 志物⑶34+、VEGFR-2(也可寫成⑶309) +表達就越低）；同時批間差較大，不同人來源的標 本培養出的內皮祖細胞數量差異較大，無法穩定生產；上述這些問題都導致了 EPCs無法穩 定的生產，進而導致無法在臨床上很好的應用EPCs。
[0005] 導致EPCs增殖效果不佳的問題主要在于培養液的配方，傳統配方中為了維持 EPCs的活性通常需要加入胎牛血清，然而異源血清的加入提高了人體發生排異反應的風 險，并且，異源血清雖然營養豐富，但是對細胞活性的維持效果其實十分有限，無法達到臨 床對EPCs培養效果的需求。
[0006] 硫氧還蛋白是一類在細胞內具有氧化還原活性的酸性小分子蛋白質，具有抗氧化 并促進血管生成的作用，但其在體外的活性尚未得到證實。
【發明內容】
[0007] 有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一型硫氧還蛋白在內皮祖細胞的培 養中的應用及內皮祖細胞的培養方法，本發明通過實驗證明，一型硫氧還蛋白的加入能夠 提高EPCs的增殖倍數，延長細胞培養的時間，延緩EPCs的衰老，且成本較低。
[0008] 本發明提供了一型硫氧還蛋白在延緩內皮祖細胞衰老、提高內皮祖細胞增殖效率 中的應用。
[0009] 硫氧還蛋白是細胞內可溶性、對熱穩定、具有氧還原活性的酸性小分子蛋白質，一 型硫氧還蛋白位于細胞漿和細胞核中，包含108個氨基酸殘基。現有技術表明，一型硫氧還 蛋白在多種刺激特別是氧化應激條件下可誘導表達，提示一型硫氧還蛋白是細胞抵抗氧化 應激的重要分子，能夠保護組織或細胞免受多種刺激的損傷。且一型硫氧還蛋白在炎性病 變組織中高表達、具有抗氧化、抗凋亡、類趨化因子細胞因子活性，能夠調芐基因表達，保護 再灌注損傷、調節蛋白質的亞硝基化。
[0010] 本發明提供的實驗證實，在培養液中添加一型硫氧還蛋白培養EPCs，細胞傳代7 代仍保持旺盛的生長和良好的活力，傳代7代細胞增殖1686倍，細胞傳代10代，表面標志 物⑶309的表達量為98 %，干細胞特性保持良好。以上實驗結果說明，一型硫氧還蛋白能夠 提高EPCs的增殖倍數，延長細胞培養的時間，延緩EPCs的衰老。
[0011] 本發明還提供了一種內皮祖細胞培養液，包括基礎培養液、人類轉化因子、干細胞 生長因子、丙酮酸鈉、胰島素、牛血清白蛋白、堿性成纖維生長因子、血管內皮生長因子和一 型硫氧還蛋白。
[0012] 在本發明的實施例中，基礎培養液為DMEM/F12培養液。
[0013] 在本發明的實施例中，人類轉化因子、干細胞生長因子、胰島素、牛血清白蛋白、 堿性成纖維生長因子、血管內皮生長因子和一型硫氧還蛋白的質量比為15 :15 :15000 : 40000 :20 :20 : (10 ~40)。
[0014] 在一些實施例中，人類轉化因子、干細胞生長因子、胰島素、牛血清白蛋白、堿性成 纖維生長因子、血管內皮生長因子和一型硫氧還蛋白的質量比為15 :15 :15000 :40000 :20 : 20 ：40〇
[0015] 在一些實施例中，一型硫氧還蛋白的濃度為10ng/mL~40ng/mL。
[0016] 優選的，一型硫氧還蛋白的濃度為40ng/mL
[0017] 在一些實施例中，丙酮酸鈉的濃度為20 μ mol/mL。
[0018] 人類轉化因子（TGF-β)是一多功能蛋白質，能夠影響細胞生長、分化、凋亡及免 疫調節。干細胞生長因子（Stem Cell Growth Factors)為一種具有刺激自體內源性干細 胞生長的高效蛋白質、酶組合，也是體外培養干細胞必不可少的各種細胞生長因子的組合， 富含表皮生長因子（EGF)、纖維細胞生長因子（FGF)、神經生長因子（NGF)、肝細胞生長因 子（HGF)、腦源性神經營養因子（BDNF)、血小板源性生長因子（PDGF)、血管內皮生長因子 (VEGF)、轉化生長因子（TGF)等多重有效成分。胰島素能夠促進細胞生長，提高細胞對葡萄 糖的利用率。牛血清白蛋白在動物細胞無血清培養中，添加白蛋白可起到生理和機械保護 作用和載體作用。堿性成纖維生長因子（bFGF)在體內具有潛在的促血管生成活性。血管 內皮生長因子（VEGF)由多數腫瘤細胞、傷口中角質細胞和巨噬細胞產生，其受體僅表達于 血管內皮細胞表面，能增加血管通透性，促進血管內皮細胞增殖，促進血管形成。丙酮酸鈉 可以作為細胞培養中的替代碳源。本發明在基礎培養液中添加上述生長因子，從而對內皮 祖細胞的生長起到良好的促進作用。維持了內皮祖細胞良好的生長活力和干細胞特性。
[0019] 本發明還提供了一種內皮祖細胞的培養方法，包括：以本發明提供的培養液將單 個核細胞懸浮至密度為I X IO4個/mL~9X 10 4個/mL，培養24h后，去除培養液及未貼壁 細胞，以本發明提供的培養液培養至細胞70 %~90 %融合，傳代。
[0020] 在本發明的實施例中，單個核細胞的制備方法為：將臍帶血或骨髓經ficoll淋巴 細胞分離液分離后以PBS緩沖液清洗，制得單個核細胞。
[0021] 在本發明的實施例中，傳代的次數為10次。
[0022] 層黏連蛋白包被能夠促進細胞貼壁。
[0023] 在本發明的實施例中，培養采用經層黏連蛋白包被的容器，層黏連蛋白包被的濃 度為 10 μ g/mL。
[0024] 在本發明的實施例中，培養的溫度為37°C，條件為5% C02。
[0025] 本發明提供了一型硫氧還蛋白在延緩內皮祖細胞衰老、提高內皮祖細胞增殖效率 中的應用。并提供的培養內皮祖細胞的培養液和培養方法。本發明在基礎培養液中添加多 種生長因子并添加一型硫氧還蛋白，從而對內皮祖細胞的生長起到良好的促進作用。維持 了內皮祖細胞良好的生長活力和干細胞特性。本發明提供的實驗證實，在培養液中添加一 型硫氧還蛋白培養EPCs，細胞傳代7代仍保持旺盛