腸膜明串珠菌及其在低溫青貯中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物領域，涉及一株腸膜明串珠菌及其在低溫青貯中的應用。
【背景技術】
[0002] 青貯是在乳酸菌的厭氧發酵作用下將碳水化合物轉化為有機酸，從而使pH降低 達到長期貯存的目的。乳酸菌和溫度是青貯飼料發酵品質好壞的決定性因素。
[0003] 燕麥是高寒地區冬春飼補的主要飼料作物，由于高寒地區溫度低海拔高，不利于 乳酸菌的生長，很難發酵出品質優良并可以長期貯存的飼料。
[0004] 因此，篩選出耐高低溫、耐鹽、耐酸堿的抗逆性較強的菌株，并將其作為發酵劑添 加到低溫青貯燕麥飼料中，將會對高寒地區的青貯飼料制作有著巨大的應用價值。
【發明內容】
[0005] 本發明的第一個目的是提供一株腸膜明串珠菌。
[0006] 本發明所提供的腸膜明串珠菌具體為腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl_1135,該菌株已于2015年4月28日保藏于中國典型培養物保藏中心 (簡稱CCTCC，地址為：湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學校內武漢大學保藏中 心），其保藏編號為CCTCC NO :M 2015256。
[0007] 所述腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl_1135從中國青海省貴德 丹霞地貌冰草分離得到的，該菌株單菌落為圓形，革蘭氏染色陰性，不產過氧化氫；該菌株 能夠發酵葡萄糖產氣，為異型發酵。在5°C和10°C長勢良好，45°C環境生長微弱，在50°C生 長良好，表明該菌株均有良好的耐低溫生長能力。在3. 00%的NaCl濃度中均生長良好，在 6. 50%的NaCl濃度中也可以存活，表明該菌株具有一定的耐鹽能力。液體5°C培養7-14 天，該菌株的上清液pH分別降到3. 5,產酸能力較好。該菌株在pH3. 0-9. 0的環境中生長良 好，表明該菌株有較好的耐酸堿生長能力。其16S rDNA序列如序列表中序列1所示。
[0008] 本發明的第二個目的是提供一種菌劑。
[0009] 本發明所提供的菌劑的活性成分為所述腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl-1135CCTCC NO ：M 2015256〇
[0010] 所述菌劑除了包含作為活性成的所述腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl-1135CCTCC Ν0:Μ 2015256 外，還可包含輔料，如 MRS 固體培養基（溶 劑為水，溶質及其濃度如下：蛋白胨l〇g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水 合乙酸鈉 5g/L，吐溫801g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬酸銨2g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 25g/ L，瓊脂17g/L)等。
[0011] 本發明的第三個目的是提供一種青貯飼料添加劑。
[0012] 本發明所提供的青貯飼料添加劑的活性成分為所述腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl-1135CCTCC NO ：M 2015256〇
[0013] 本發明的第四個目的是提供一種青貯飼料。
[0014] 本發明所提供的青貯飼料中含有所述青貯飼料添加劑。
[0015] 所述腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QH1-1135CCTCC NO :M 2015256 或所述菌劑在如下任一中的應用也屬于本發明的保護范圍：
[0016] (al)抑制細菌；
[0017] (a2)制備細菌抑制劑；
[0018] (a3)制備所述青貯飼料添加劑；
[0019] (a4)制備所述青貯飼料。
[0020] 所述（al)的應用為非疾病診斷或治療的應用。
[0021] 在所述（al)和所述（a2)中，所述細菌具體可為藤黃微球菌和/或沙門氏菌。
[0022] 其中，所述腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QH1-1135CCTCC NO : M2015256或所述菌劑對所述細菌的抑制具體體現為30°C條件下的抑制。
[0023] 所述青貯飼料添加劑在制備所述青貯飼料中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0024] 本發明的第五個目的是提供一種制備所述青貯飼料的方法。
[0025] 本發明所提供的制備所述青貯飼料的方法，具體可包括：將青貯原料與所述腸膜 明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QHl_1135CCTCC NO :M 2015256 混合，進行固體厭 氧發酵，收集所有發酵產物，得到所述青貯飼料；
[0026] 在本發明中，所述青貯原料為燕麥全株；具體為乳熟期燕麥全株，水分含量 82. 97%，切割成l-2cm小段。
[0027] 在所述方法中，所述燕麥全株和所述腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides) QH1-1135CCTCC NO :M 2015256 的配比可為 100g :105cfu ;所述發酵為低溫 發酵；所述低溫可為5°C ;所述發酵的時間可為30天。
[0028] 本發明所提供的腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QH1-1135CCTCC NO :M 2015256具有耐低溫、耐鹽、耐酸堿等抗逆性，并在低溫青貯（5°C)過程中迅速繁殖并 產酸降PH，有效的抑制有害雜菌的生長或產生，粗蛋白質、粗脂肪、粗纖維等營養成分有效 保留，非營養物質如粗灰分成分降低，達到長期保存青貯飼料的效果。
[0029] 保藏說明
[0030] 菌種名稱：腸膜明串珠菌
[0031] 拉丁名：（Leuconostoc mesenteroides)
[0032] 菌株編號：QH1-1135
[0033] 保藏機構：中國典型培養物保藏中心
[0034] 保藏機構簡稱：CCTCC
[0035] 地址：湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學校內武漢大學保藏中心
[0036] 保藏日期：2015年4月28日
[0037] 保藏中心登記入冊編號：CCTCC NO :M 2015256
【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0040] 實施例1、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)QH1-1135的分離與鑒定
[0041] 一、菌株QH1-1135的分尚與篩選
[0042] 取中國青海省貴德丹霞地貌冰草10g，放入90mL無菌水，震蕩10秒，吸取ImL液體 放于I. 5mL離心管，依次稀釋101，103, IO5倍，取稀釋液體20 μ L分別涂布到MRS瓊脂培養 基上，30°C厭氧培養48小時，取單菌落MRS固體培養基擴大培養，將獲得的其中一株菌編號 為 QH1-1135。
[0043] 其中，所述MRS固體培養基的溶劑為水，溶質及其濃度如下：蛋白胨10g/L，牛肉膏 10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，三水合乙酸鈉5g/L，吐溫801g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬 酸銨2g/L，硫酸鎂2g/L，硫酸錳0. 25g/L，瓊脂17g/L。
[0044] 二、菌株 QH1-1135 的鑒定
[0045] 從以下幾個方面對步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-1135進行鑒定。
[0046] 1、形態學鑒定
[0047] 步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-1135單菌落革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察單 菌落形狀呈圓形。
[0048] 2、生理生化特征鑒定
[0049] 步驟一分離并篩選得到的菌株QH1-1135革蘭氏染色陰性，不產過氧化氫；能夠發 酵葡萄糖產氣，為異型發酵。
[0050] 利用API 50CH檢測菌株QH1-1135對不同碳源的發酵利用情況。結果如表1所 示。可見，菌株QH1-1135可以發酵利用半乳糖，葡萄糖，D-甘露糖，七葉靈，纖維二糖，蔗 糖，核糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，α-甲基-D-葡糖苷，蜜二糖，甘露醇，麥芽糖，松三糖，棉子 糖，D-果糖做碳源；不可以發酵利用D-阿拉伯糖醇，甘油，D-阿拉伯糖，β -甲基-木糖苷， L-木糖，半乳糖醇，纖維糖，葡糖酸鹽，糖原，木糖醇，2-酮基-葡糖酸鹽，D-海藻糖，L-阿拉 伯醇，D-來蘇糖，赤藻糖醇，5-酮基-葡糖酸鹽，核糖醇，L-山梨糖，乳糖，鼠李糖，山梨糖， 淀粉，苦杏苷，熊果苷，α -甲基-D-甘露糖，菊糖，β -龍膽二糖，塔格糖，L-海藻糖做碳源； 可以微弱發酵利用水楊苷，海藻糖，N-乙酰葡糖胺，D