一種漁用海洋微生態制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生態制劑的技術領域，尤其涉及一種漁用海洋微生態制劑及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] 目前水產養殖業存在著病害越來越嚴重，傳統的抗生素和化工消毒劑難以為繼， 由此產生的養殖水體排放給養殖區帶來了嚴重污染，從九十年代開始光合細菌在水產養殖 上應用技術不斷進步，近幾年以來益生素在水產養殖上的應用方興未艾，芽孢桿菌在養殖 業上推廣的技術日趨成熟，給微生物在水產養殖業上的應用提供了可借鑒的依據，中國臺 灣九十年代就把乳酸菌應用于養殖業，至今具備一定的應用水平，我國對乳酸菌的研宄和 應用只是剛剛開始，乳酸菌具有定植養殖動物腸道抑制病原菌和助消化吸收；消除水體的 有機物，有害物質等特性，對水產養殖可持續發展提供了有力的保障。
[0003] 植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)屬于乳桿菌科，乳桿菌屬，革蘭氏陽 性。植物乳桿菌是同型發酵乳酸菌，在發酵過程中只產生乳酸，是典型的兼性厭氧菌，有很 強的發酵碳水化合物的能力，較耐鹽，與其它乳酸菌有協同作用。戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)屬于球菌，乳酸菌屬，革蘭氏陽性，兼性厭氧性，具有產酸高、性能穩定、降解 效果佳、耐鹽性較高等優勢，常用于秸桿發酵及飼料添加劑。植物乳桿菌和戊糖片球菌是農 業部2013年第2045號公告《飼料添加劑品種目錄（2013)》中規定做為微生態制劑可以直 接飼喂養殖動物的飼料級微生物添加劑菌種。植物乳桿菌和戊糖片球菌是乳酸菌的兩個不 同種類。
[0004] 在現有技術中，植物乳桿菌和戊糖片球菌通常是被分別用來作為水產生物的微生 物添加劑，對于兩者的綜合運用，還鮮有報道。有鑒于此，本發明人研宄和設計了一種漁用 海洋微生態制劑及其制備方法，本案由此產生。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種漁用海洋微生態制劑及其制備方法，本發明對植物乳 桿菌和戊糖片球菌，篩選出規模化生產的培養基配方，以提高飼料效率，進而促進植物乳 桿菌和戊糖片球菌微生態制劑在水產養殖上的推廣應用。
[0006] 為實現上述目的，本發明解決其技術問題的技術方案是：
[0007] -種漁用海洋微生態制劑，包括植物乳桿菌及戊糖片球菌，所述植物乳桿菌及所 述戊糖片球菌的菌數比為2:1。
[0008] -種漁用海洋微生態制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0009] 步驟一、菌種的活化與擴大培養：
[0010] 一級培養：在超凈工作臺中取斜面保存單菌落至100mL滅菌MRS培養基中，置于 35°C恒溫水浴搖床上培養24h ;植物乳桿菌和戊糖片球菌各接種4瓶，目的是活化菌種；24h 后取菌液涂布MRS平板多個，置于35°C恒溫箱內靜置培養24h，待菌落長出，置于4°C冰箱保 種，待用；
[0011] 二級培養：在超凈工作臺中取斜面保存單菌落接種至200ml滅菌MRS中，兩種菌各 共接種6瓶，置于35°C恒溫水浴搖床上培養24h ;
[0012] 三級培養：取培養好的菌液IOml至2000ml滅菌MRS培養基中，置于35°C恒溫水 浴搖床上培養24h，得到種子液，采用真空干燥法生產植物乳桿菌2kg、戊糖片球菌30kg，菌 數均達億級；
[0013] 步驟二、發酵培養基的配制：
[0014] 蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉2g，梓 檬酸二鈉2g，七水合硫酸鎂0. 5g，五水硫酸錳0. 2g，吐溫-801ml，定容至IL ;
[0015] 步驟三、發酵培養：
[0016] 將所述植物乳桿菌及所述戊糖片球菌按菌數比為2:1的混合菌接種于所述發酵 培養基，接種量為2%，所述發酵培養基中按C:N為12:1添加葡萄糖和大豆蛋白胨，發酵溫 度35°C、初始PH為6. 5,攪拌為12h攪拌1次，每次攪拌時間為5min，以PH達到4. 0以下為 發酵終點；
[0017] 步驟四、過濾出料：
[0018] 發酵至終點后，對發酵液進行過濾出料，再進行分裝，制得本漁用海洋微生態制 劑。
[0019] 作為實施例的優選方式，所述混合菌的菌數為10億/g。
[0020] 本發明對植物乳桿菌和戊糖片球菌，篩選出了規模化生產的培養基配方，大大提 高了飼料效率，植物乳桿菌和戊糖片球菌的代謝產物具有協同作用的能力，在生產應用中 遠遠高于單體的效能，有效促進了植物乳桿菌和戊糖片球菌微生態制劑在水產養殖上的推 廣應用。
【附圖說明】
[0021] 圖1兩種乳酸菌的比例對其代謝產物的影響；
[0022] 圖2碳源對兩種乳酸菌生長的影響；
[0023] 圖3氮源對兩種乳酸菌生長的影響；
[0024] 圖4緩沖鹽對兩種乳酸菌生長的影響；
[0025] 圖5生長因子對兩種乳酸菌生長的影響；
[0026] 圖6不同接種量對植物乳桿菌和戊糖片球菌發酵的影響；
[0027] 圖7不同發酵溫度對植物乳桿菌和戊糖片球菌發酵的影響；
[0028] 圖8不同初始pH對植物乳桿菌和戊糖片球菌發酵的影響。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1
[0030] 一種漁用海洋微生態制劑，包括植物乳桿菌及戊糖片球菌，所述植物乳桿菌及所 述戊糖片球菌的菌數比為2:1。
[0031] 取此配比實驗的發酵液進行養殖中試，經過10天投喂，實驗組的蝦個體明顯大于 其他組，腸道較粗，蠕動能力強，攝食快。因此，植物乳桿菌與戊糖片球菌的最佳發酵比例為 2:1〇
[0032] 我們對0. 7cm的幼蝦進行乳酸菌投喂，對比沒有投喂的各組，效果顯示尤為明顯， 按照2 :1配比投喂的幼蝦，表現在活力強、受驚嚇時彈跳反應較為明顯、腸道較粗、蠕動能 力強、尾扇展開幅度較大等特點。
[0033] 實施例2
[0034] 一種漁用海洋微生態制劑的制備方法，包括以下步驟：
[0035] 步驟一、菌種的活化與擴大培養：
[0036] 一級培養：在超凈工作臺中取斜面保存單菌落至100mL滅菌MRS培養基中，置于 35°C恒溫水浴搖床上培養24h ;植物乳桿菌和戊糖片球菌各接種4瓶，目的是活化菌種；24h 后取菌液涂布MRS平板多個，置于35°C恒溫箱內靜置培養24h，待菌落長出，置于4°C冰箱保 種，待用；
[0037] 二級培養：在超凈工作臺中取斜面保存單菌落接種至200ml滅菌MRS中，兩種菌各 共接種6瓶，置于35°C恒溫水浴搖床上培養24h ;
[0038] 三級培養：取培養好的菌液IOml至2000ml滅菌MRS培養基中，置于35°C恒溫水 浴搖床上培養24h，得到種子液，采用真空干燥法生產植物乳桿菌2kg、戊糖片球菌30kg，菌 數均達億級；
[0039] 所述MRS培養基為：蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氫二 鉀2g，乙酸鈉2g，檸檬酸二鈉2g，七水合硫酸鎂0. 5g，五水硫酸錳0. 2g，吐溫-801ml，定容 至1L。
[0040] 步驟二、發酵培養基的配制：
[0041] 蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉2g，梓 檬酸二鈉2g，七水合硫酸鎂0. 5g，五水硫酸錳0. 2g，吐溫-801ml，定容至IL ;
[0042] 步驟三、發酵培養：將所述植物乳桿菌及所述戊糖片球菌按菌數比為2:1的混合 菌接種于所述發酵培養基，接種量為2%，所述發酵培養基中按C:N為12:1添加葡萄糖和大 豆蛋白胨，發酵溫度35°C、初始PH為6. 5,攪拌為12h攪拌1次，每次攪拌時間為5min，以 PH達到4.0以下為發酵終點；
[0043] 步驟四、過濾出料：發酵至終點后，對發酵液進行過濾出料，再進行分裝，制得本漁 用海洋微生態制劑。
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