一株納豆芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株納豆芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 在飼料工業中，蛋白質飼料占有重要的地位，是配合飼料生產過程中補充飼料蛋 白不足必不可少的飼料原料。蛋白質飼料的代表性飼料有植物性餅柏、動物性魚粉、血粉和 微生物蛋白飼料等。植物性餅柏是飼料行業中最重要的植物性蛋白飼料，其中以大豆餅柏 應用最為廣泛，它是一種優質的蛋白質飼料來源，是各種配合飼料中的重要成分。
[0003] 賴氨酸是人和動物的必需氨基酸之一，在飼料中添加適量的賴氨酸有利于動物 的生長、改善氨基酸平衡、提高飼料利用率、節約蛋白質資源。在餅柏類飼料中添加限制性 氨基酸，可以替代魚粉，降低飼料成本，改善肉的品質，添加賴氨酸能改善屠體質量，提 高瘦肉率。
[0004] 近年來，動物性蛋白在逐漸減少，大豆餅柏作為作為較理想的蛋白飼料源而被大 規模使用。大豆柏的粗蛋白含量在30%-40%之間，必需氨基酸比例組成較好，飼料配合中 需添加賴氨酸以增加飼料氨基酸營養的全面性和均衡性。隨著微生物在飼料行業上的研宄 深入，微生物菌種在飼料中的應用逐步受到人們的關注。微生物發酵技術在豆柏的研宄已 在國外展開，據國外研宄表明：大豆柏經微生物發酵后，賴氨酸等限制性氨基酸含量明顯曾 加，蛋白質的利用率進一步提高，同時增加飼料原料中可以利用的種類，可為幼畜、幼禽和 水產養殖提供優質蛋白來源。
[0005] 納豆芽孢桿菌是在二十世紀中期被發現并且分離培養出來，它具有很高活性的蛋 白酶、脂肪酶和淀粉酶，能夠降解植物性飼料中的某些復雜的碳水化合物，分解蛋白質。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是如何提高飼料用大豆柏的賴氨酸含量和/或粗蛋 白含量。
[0007] 為解決以上技術問題，本發明提供了一株納豆芽孢桿菌。
[0008] 本發明所提供的納豆芽孢桿菌，菌株編號為NF01-6,其在中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 10535。
[0009] 納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535 菌體桿狀，大小 (0. 7-0. 8)umX (I. 5-1. 8)um，運動，鞭毛側生。革蘭氏陽性。內生孢子，具有較強耐熱性。芽 孢橢圓形或柱狀，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不顯著，生長溫度最高為45-55?，最低 為5-20°C。菌落近似圓形，邊緣參差不整齊，表面微皺褶，不光滑，不透明。
[0010] 納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535 的 16S rDNA序列如 SEQ ID No. 1 所示。
[0011] 為解決以上技術問題，本發明還提供了以納豆芽孢桿菌（Bacillus natto) NF01-6CGMCC No. 10535為活性成分的菌劑。
[0012] 所述菌劑具體可為用于發酵植物蛋白飼料的菌劑。
[0013] 所述菌劑具體可由所述納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535 和載體組成；所述載體具體可為磷酸鈣、稻殼粉、麩皮、米糠、脫脂奶粉、麥芽糊精、蔗糖、甘 油和淀粉中的至少一種。
[0014] 上述納豆芽孢桿菌或上述菌劑在植物蛋白飼料發酵中的應用以及在制備飼料中 的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0015] 本發明還提供了培養所述納豆芽孢桿菌的方法。
[0016] 本發明所提供的培養所述納豆芽孢桿菌的方法，包括將所述納豆芽孢桿菌在用于 培養芽孢桿菌的培養基中培養的步驟。
[0017] 本發明還提供了上述菌劑的制備方法。
[0018] 本發明所提供的上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將所述納豆芽孢桿菌作為 活性成分和所述載體混合，得到所述菌劑。
[0019] 上文中，所述植物蛋白飼料可為大豆柏。
[0020] 含有所述納豆芽孢桿菌的飼料也屬于本發明的保護范圍。
[0021] 實驗證明，納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535發酵含大 豆柏培養基得到的發酵產物的賴氨酸含量和粗蛋白含量比不接菌的對照顯著增加：5%豆 柏固體發酵培養基、10%豆柏固體發酵培養基和15%豆柏固體發酵培養基培養納豆芽孢 桿菌（Bacillus natto)NF01-6得到的發酵產物的粗蛋白含量比對照分別增加3.626%、 4. 557%和0. 191 %，賴氨酸含量比對照分別增加25. 60%、45. 60%和38. 50%。納豆芽孢桿 菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535有效地提高了植物蛋白中的賴氨酸含量，提 高了植物性蛋白飼料可利用性，具有較高的實用性和可推廣性。本發明在植物性蛋白飼料 應用領域具有廣闊的前景。
[0022] 保藏說明
[0023] 菌種名稱：納豆芽孢桿菌
[0024] 拉丁名：Bacillus natto
[0025] 菌株編號：NF01-6
[0026] 保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0027] 保藏機構簡稱：CGMCC
[0028] 地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號
[0029] 保藏日期：2015年2月6日
[0030] 保藏中心登記入冊編號：CGMCC No. 10535
【具體實施方式】
[0031] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0032] 納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535液體培養基的配制方 法：蛋白胨 5g，牛肉膏 5g，NaCl 5g，MnSO4 · H2O 5mg，用水定容至 lOOOmL，pH 值為 6. 8-7. 2。
[0033] 納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535固體培養基的配制方 法：蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，MnS04.H20 5mg，瓊脂22g，用水定容至1000mL，pH值為 6. 8_7. 2〇
[0034] 實施例1、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535的保藏及培養
[0035] 1、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01_6的分離、鑒定和保藏
[0036] 取自然發酵的大豆柏，用平板（蛋白胨5g，牛肉膏5g，NaCl 5g，瓊脂22g，用水定 容至100〇1111^口!1值為6.8-7.2)劃線分離方法得到納豆芽孢桿菌（1^(3；[11118 1^1:1:0)即01-6。 納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01_6已于2015年02月06日保藏于中國普通微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 10535。
[0037] 2、納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535 的斜面培養
[0038] 挑取該菌種，對其用上述納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01_6 CGMCC No. 10535固體培養基進行斜面培養，在32°C下培養40h。
[0039] 3、菌種的液體培養
[0040] 挑取步驟2斜面培養的納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535， 將其接種于500mL上述納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535液體培養 基中，32 °C恒溫搖床220r/min培養30h。
[0041] 4、菌株的鑒定
[0042] 4. 1、形態學鑒定
[0043] 將處于對數生長期，且菌落大小穩定，上述步驟1分離并純化得到的納豆芽孢桿 菌（Bacillus natto)NF01-6進行單菌落狀態描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕 潤度、菌落表面狀態（是否平坦、突起、褶皺、凹陷等）、菌落邊緣狀態（是否整齊、不規則、放 射狀等）。另一方面，對處于對數生長期的納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6,經涂片 染色后采用光學顯微鏡觀察菌體的形態。
[0044] 結果表明納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6 CGMCC No. 10535菌體桿狀，大 小（0. 7-0. 8) μ mX (1. 5-1. 8) μ m，運動，鞭毛側生。革蘭氏陽性。內生孢子，具有較強耐熱 性。芽孢橢圓形或柱狀，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不顯著，生長溫度最高為45-55?， 最低為5-20°C。菌落近似圓形，邊緣參差不整齊，表面微皺褶，不光滑，不透明。
[0045] 4. 2、16S rDNA 序列分析
[0046] 采用菌落PCR方法擴增納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01_6的16S rDNA片段 并克隆測序。結果表明納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01-6具有SEQ ID No. 1的16S rDNA片段序列。
[0047] 4. 3、生理生化特征鑒定
[0048] 參考《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊.北京： 科學出版社，2011.)和《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Second Edition Volume Three》測定納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01_6的生理生化特征。
[0049] 結果表明納豆芽孢桿菌（Bacillus natto)NF01_6好氧生長；接觸酶陽性；V-P反 應陽性；利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、阿拉伯糖和木糖；水解淀粉、酪素；明膠液化；利用檸檬 酸鹽；可還原硝酸鹽；不利用尿素。
[0050] 鑒于上述形態、生理生化特征分析和16s rDNA序列分析結果，將納豆芽孢桿菌 (Bacillus natto)NF01_