一種腸桿菌及其在降解木質素中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種腸桿菌及其在降解木質素中的應用，屬于微生物技術領域。
【背景技術】
[0002]木質素是一種廣泛存在于植物體中的無定形的、分子結構中含有氧化苯丙醇或其衍生物結構單元的芳香性高聚物，是自然界中在數量上僅次于纖維素的第二大天然高分子材料。木質素由于結構和性質的特殊性，使其在工業、農業、醫藥方面有廣泛的應用。在工業上，可用其制備燃料分散劑、粘合劑、皮革鞣劑、混凝土減水劑和乳化穩定劑；在農業上，可用作植物生長劑、高效氮肥、沙土穩定劑、液體地膜和農藥緩釋劑；在醫藥方面，可制造香蘭紫、抗菌增效劑TMP、抗炎劑、抗癌劑和興奮劑等。制楽造紙工業每年從植物中分離出大約1.4億噸纖維素，同時得到5000萬噸左右的木質素副產品。但是超過95%的木質素主要作為工業制漿的廢棄物，隨廢水直接排入江河或濃縮后燒掉。造紙黑液的直接排放造成很大的資源浪費，同時也對環境造成了嚴重的污染。因此木質素降解研宄對經濟發展和環境治理保護都具有現實意義。
[0003]目前，木質素的降解主要采用理化處理和生物降解。理化處理成本較高，且易造成二次污染。篩選并利用微生物不僅可以緩解環境污染，生產生物能源，還可以通過控制性的解聚，變廢為寶，生成有利用價值的芳香族化合物，實現資源再利用。目前，一般認為木質素的完全降解是真菌、細菌和相關微生物群落共同作用的結果，其中真菌起著主要的作用。降解木質素最常見的真菌主要是白腐真菌、褐腐真菌、和軟腐真菌，而白腐菌是自然界中最主要的木質素降解菌。目前，研宄較多的白腐菌有:黃孢原毛平革菌(/7AaflerocAeiechrysospori urn).、煙管(Berkandera adjus ted)、變色檢菌(Thame tes ersi coo)等。除真菌外，細菌也是木質素生物降解過程中的一個重要的參與者。能降解木質素的細菌種類很多，放線菌是降解能力較強的一類細菌，包括鏈霉菌(trep tomyces)、節桿菌(AriAroAacter)、小單胞菌?Micromonospora)和諾卡式菌iNocardia)等。能夠降解木質素的非絲狀細菌主要是不動桿菌tobacter)、黃桿菌屬(/7Zavobacterium)、微球菌屬(#icrococcw5.)、假單胞桿菌iPesudomonas)和黃單胞桿菌iXmithomorms)。雖然目前已發現可降解木質素的微生物不少，但降解效率都普遍不高。白蟻作為自然界中可高效降解木質纖維素的昆蟲，其后腸中寄居這大量共生微生物，Katsumata等(2007)和Ke等(2010)分別以麻頭堆砂白蟻(Cryp to termes bre vis)和臺灣乳白蟻(Cop to termes formosamusshiraki )為研宄對象檢測到木質素在白蟻體內的降解和修飾。
[0004]本發明從圓唇散白蟻腸道內中篩選出一株可高效降解木質素的腸桿菌{Enterobacter sp.) YC105C，這是首次從圓唇散白蟻篩選出可降解木質素的腸桿菌的報道。
【發明內容】
[0005]本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種腸桿菌{Enterobacter sp.)YC105C。
[0006]本發明的另一目的在于提供所述腸桿菌在環保領域中的應用，特別是在生物降解木質素方面的應用。
[0007]本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種腸桿菌(■feteroAacier sp.)YC105C，于2014年3月20日保藏于中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC N0.8941。
[0008]所述腸桿菌sp.) YC105C具有以下的形態和生理生化特性:
A、采用常規的細菌生理生化鑒定方法和掃描電鏡觀察，為革蘭氏陰性桿狀細菌；
B、主要的生理生化特征兼性厭氧，具有運動性，接觸酶、氧化酶陽性，水解明膠和淀粉，吲哚試驗陰性。
[0009]所述腸桿菌5/?.)YC105C 的 16S rRNA 序列如 SEQ ID N0.1 所不。
[0010]所述腸桿菌sp.)YC105C在環保領域中的應用，特別優選所述腸桿兔{Enterobacter sp.) YC105C應用于生物降解木質素，包含以下步驟:
將含有木質素的無機鹽培養基PH值調至6.0-8.0，然后將0D600值0.4-0.5(對數增長期)的腸桿菌sp.) YC105C按體積比10-40%的接種量接種，于25_37°C進行反應，所述反應為振蕩反應，振蕩速度為100-220rpm。
[0011]其中，無機鹽培養基中木質素的濃度為20-100mg/L ;
所述的反應時間為72-108h。
[0012]本發明的有益效果:
腸桿菌YC105C是首次從圓唇散白蟻內篩選出的可高效降解木質素的腸桿菌{Enterobacter sp.)。腸桿菌(ihferoAacier sp.)YC105C對木質素的降解率可達90-100%，遠高于其他木質素降解菌的木質素降解率。
【具體實施方式】
[0013]下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0014]實施例1:
本發明所述的具有降解木質素能力的腸桿菌sp.)YC105C從江蘇省鎮江市南山風景區采集的圓唇散白蟻腸道內分離、純化而得。
[0015]其分離方法如下:
所用的馴化培養基為無機鹽培養基(g/L):6.2g Na2HPO4, 3.0g KH2PO4,0.5g NaCl，1.0g NH4Cl0
[0016]抽取20頭圓唇散白蟻腸道，用勻漿器充分研磨，然后以體積百分比10%接種量將勻漿液接入5ml含20mg/L木質素pH 7.0的無機鹽培養液中，30°C馴化3天后，待無機鹽培養基中出現渾濁后，以體積百分比10%接種量接入含木質素40mg/L的無機鹽培養基接著馴化3天，依次類推逐步提高木質素的濃度進行馴化，木質素的濃度分別為60mg/L、80mg/L、100mg/L。馴化結束后將馴化液涂布于pH7.0 LB瓊脂平板(10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母粉，10.0 g NaCl ,15.0 g瓊脂粉，g/L)上30°C培養48h，挑選單菌落于LB瓊脂平板上進行富集培養，然后測定降解率，選擇降解率最高的菌種進行純化。
[0017]降解率的測定:將單菌種接種于5mL LB液體培養基中培養18h，然后將菌液(0D600為0.45)以體積比10%的接種量接入含有20mg/L木質素pH7.0的無機鹽培養基中，在30°C，150rpm搖床中反應96h，定時取樣通過紫外分光光度計測定菌種對木質素的降解率。
[0018]降解率=(初始濃度-終濃度)/初始濃度。
[0019]紫外分光光度法用以測定木質素的濃度，以超純水為對照，紫外分光光度計檢測波長為280nmo
[0020]將純化得到的菌落進行鑒定，鑒定結果如下:
(I)菌體的形態特性:
A、采用常規的細菌生理生化鑒定方法和電子顯微鏡觀察，為革蘭氏陰性桿狀細菌，周生鞭毛；
B、主要的生理生化特征兼性厭氧，具有運動性，接觸酶、氧化酶陽性，水解明膠和淀粉，吲哚試驗陰性。
[0021](2)采用DNA提取方法提取細菌總DNA。采用細菌的16S rRNA通用引物F27(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3’)，下游引物 R534(5’-ATTACCGCGGCTGCTGGC_ 3’)擴增其 16SrRNA基因。PCR擴增體系總體積為50 μ?，無菌超純水37.5μ?，10XP