一種低溫生產幾丁質酶的菌株及其發酵方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種交替假 單胞菌屬的海洋細菌，特別是一種低溫生產幾丁質酶的菌株及其發酵方法研究。該發明生 產的幾丁質酶主要應用于食品工業、釀造、發酵、醫藥等行業。
【背景技術】
[0002] 幾丁質酶是催化幾丁質水解生成N-乙酰氨基葡萄糖的酶。幾丁質（Chitin)又稱 甲殼質或甲殼素，是一種由N-乙酰氨基葡萄糖以β -1，4-糖苷鍵連接而成的生物直鏈多聚 物，廣泛分布與自然界。自然界每年生成的幾丁質約一百億噸，陸地儲量僅次于纖維素，海 洋環境中含量最豐富的多糖。
[0003] 目前已確定出3種以氫鍵相連的天然結晶形態：含量最大的a-幾丁質，由兩條 反向平行鏈組成，多氫鍵相連，浸水不脹；β -幾丁質，由兩條同向平行鏈構成，分子鏈間的 氫鍵較小幾丁質少的多，遇水會膨脹；Y -幾丁質，為三條鏈，兩條同向，一條反向，類似于 a-和β-幾丁質的混和晶體。幾丁質由于分子內氫鍵較強，所以穩定性強、溶解性能差（不 溶于水、稀酸、稀堿和一般有機溶劑）。
[0004] 幾丁質若脫乙酰化即成殼聚糖（Chitosan)，是啤酒酵母的子囊孢子外殼、毛霉細 胞壁的主要成分。殼聚糖的溶解性大為改善，雖不能直接溶于水但卻能溶于酸或酸性水溶 液中。幾丁質分子中的氨基并非全部置換成N-乙酰氨基基團，分子中還存在一些游離的氨 基基團，幾丁質正是通過這種呈堿性的氨基基團與適當的離子基團如β_葡萄糖胺、特定 蛋白質等結合成絡合物或共價化合物。幾丁質及其衍生物在食品、醫藥、化工、生物、農業、 紡織、印染、造紙、環保等眾多領域中均具有極其重要的用途。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種能低溫生產幾丁質酶的新菌種，并提供該新菌種的分 離培養方法和發酵研究。
[0006] 本發明所述的低溫生產幾丁質酶生產菌株DL-6,即Pseudoalteromonas sp. DL-6 菌株（0611〇：勵.8580)分離自遼寧省大連星海灣的海洋底泥中，經形態學、165扣嫩分析表 明它屬于假交替單胞菌屬（又稱交替假單胞菌屬，下同），命名為低溫生產幾丁質酶菌株 DL-6,即Pseudoalteromonas sp. DL-6。申請人已針對該菌發展了一套培養技術，能從該菌 穩定低溫發酵生產幾丁質酶。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏，保藏單位名稱：中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏日期：2013年12月13日，其 保藏編號為CGMCC NO. 8580。
[0007] 所述低溫幾丁質酶菌株的生物化學特征為：
[0008] 菌落形態特征為：菌落為淡黃色、不透明、表面光滑、邊緣整齊、易挑取。通過簡單 染色、革蘭氏染色、莢膜染色、芽孢染色等方法對該菌株生物學特性進行初步鑒定，結果表 明該菌株為細菌，桿狀、〇. 1-0. 5 μ mX 1. 3-2. 0 μ m、革蘭氏陰性、無莢膜、無芽孢、端生鞭毛。 遺傳學特征：
[0009] 所述低溫生產幾丁質酶菌株DL-6,即 Pseudoalteromonas sp. DL-6 的 16S rDNA全 基因堿基序列（表1);菌株16S ri)NA全基因序列共1450bp(Genbank登錄號為：KF208362);
[0010] I acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggtaa cagaaagtag cttgctactt
[0011] 61 tgctgacgag cggcggacgg gtgagtaatg cttgggaaca tgccttgagg tgggggacaa
[0012] 121 cagttggaaa cgactgctaa taccgcataa tgtctacgga ccaaaggggg cttcggctct
[0013] 181 cgcctttaga ttggcccaag tgggattagc tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg
[0014] 241 acgatcccta gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga
[0015] 301 ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat
[0016] 361 gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt tcagtcagga ggaaaggtta
[0017] 421 gtagttaata cctgctagct gtgacgttac tgacagaaga agcaccggct aactccgtgc
[0018] 481 cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcgag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt
[0019] 541 acgcaggcgg tttgttaagc gagatgtgaa agccccgggc tcaacctggg aactgcattt
[0020] 601 cgaactggca aactagagtg tgatagaggg tggtagaatt tcaggtgtag cggtgaaatg
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[0026] 961 agagaactta ccagagatgg tttggtgcct tcgggaactc tgatacaggt gctgcatggc
[0027] 1021 tgtcgtcagc tcgtgttgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctatc
[0028] 1081 cttagttgct agcaggtaat gctgagaact ctaaggagac tgccggtgat aaaccggagg
[0029] 1141 aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgtgt agggctacac acgtgctaca
[0030] 1201 atggcgcata cagagtgctg cgaacctgcg aaagtaagcg aatcacttaa agtgcgtcgt
[0031] 1261 agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcgtat
[0032] 1321 cagaatgacg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga
[0033] 1381 gtgggttgct ccagaagtag atagtctaac cctcgggagg acgtttacca cggagtgatt
[0034] 1441 catgactggg
[0035] 本發明菌株與交替假單胞菌屬有相似性，用Mega5. 0軟件對其16S ri)NA序列進行 系統學分析，并用鄰接法（Neigbor-Joining)構建系統樹表明本菌株與交替假單胞菌屬屬 于同一類群，關系最緊密。16S rDNA序列分析表明，與Genbank國際基因序列數據庫記錄的 最相似的菌株 Pseudoalteromonas. undina strain NCIMB2128 (WP_010389313.1)的相似 性為97%。
[0036] 本發明所述的一種微生物低溫發酵生產幾丁質酶的方法具體包括以下步驟：
[0037] (1)按常規方法將所述菌株接種于固體種子培養基上，在4~30°C培養48_96h ;
[0038] (2)按常規方法將幾丁質酶產生菌在4~30°C逐級擴大培養，制備成液體一級種 子和二級種子；
[0039] (3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的1~9%接種量接入液體發酵培 養基中，在14~20°C培養48~96h時，即微生物發酵生產低溫幾丁質酶結束；
[0040] (4)將（3)的發酵液在4, 000~8, OOOg離心收集液體，獲取發酵物；
[0041] (5)根據不同需要和使用對象不同，將⑷得到的發酵液經1000 Og離心10min去 除菌體，上清液經60%飽和硫酸銨在4攝氏度攪拌過夜，12000g離心30min，收集沉淀，用一 定量的PBS緩沖液（0. 02~0. 05M，pH7. 0-8. 0)重新溶解沉淀，再用相同緩沖液透析除鹽， 制備成液體酶制劑。
[0042] 本發明的優點：
[0043] 本發明所述的低溫生產幾丁質酶菌株（Pseudoalteromonas sp. ) DL-6的優點：
[0044] 1.本說明交替假單胞菌低溫生產幾丁質酶活性高，對目前幾丁質酶日益增加的需 求，本發明為之找到了一條新的生產途徑。
[0045] 2.該交替假單胞菌株生產低溫幾丁質酶最適溫度為14~20°C，無需加熱/冷卻 等耗能，降低生產成本，滿足工業生產需求。
[0046] 3.本說明菌株具有生產降解膠體或粉狀幾丁質能力，低溫條件下能穩定生產幾丁 質酶，在此之前未見相關報道。
【附圖說明】
[0047] 圖1.低溫生產幾丁質酶菌株的菌落；
[0048] 圖2.低溫生產幾丁質酶菌株的生長曲線；該菌株延滯期為0~6h ;對數期為6~ 24h ;穩定期為24~60h，衰亡期為60~70h。
[0049] 圖3.低溫生產幾丁質酶菌株的產酶曲線。
【具體實施方式】
[0050] 實施例1
[0051] 低溫生產幾丁質酶菌株（Pseudoalteromonas sp. ) DL-6的分離和純化。
[0052] 1.菌株的分離：
[0053] (1)采集樣品
[0054] 采集遼寧省大連市星海灣（123。371，E，39。6972, N)海洋底泥，取10g，加無菌水 90ml，制成菌懸液。
[0055] (2)菌株分離
[0056] 取菌懸液1ml，用無菌水依次稀釋KT3-KT6倍，于幾丁質酶篩選固體培養基上劃 線，幾丁質酶篩選培養基（g/L):膠體幾丁質1% ;蛋白胨0. 5% ;瓊脂粉1. 5% ;剛果紅（IOmg/ ml)0·5ml/100ml;原地（123。37ΓE，39。6972'N)海水配制。
[0057] 2.菌株的純化
[0058] 按照微生物純種分離的常規方法，將上述培養基于15°C放置2-3天。挑取多個單 菌落，接種到新的卡拉膠固體培養基上，至少重復10次，純化菌落。再在液體培養基中進行 發酵檢驗，結果得到一株低溫幾丁質酶產量較高的菌株。
[0059] 液體種子培養基：牛肉膏1.(^;胰蛋白胨5.(^;海水1.(^，1211：高壓蒸氣滅菌 30min ；
[0060] 發酵培養基：膠體或細粉幾丁質5. Og ;蛋白胨5. Og ;海水I. 0L，121°C高壓蒸氣滅 菌 30min〇
[0061] 實施例2
[0062] 低溫生產幾丁質酶菌（Pseudoalteromonas sp. ) DL-6的分離鑒定：
[0063] (1)低溫生產幾