一種巰基/二硫鍵可控自交聯透明質酸水凝膠的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物材料領域，具體涉及一種巰基/ 二硫鍵可控自交聯透明質酸水凝膠及其制備方法和應用。
技術背景
[0002]組織工程學(tissue engineering),也有人稱其為“再生醫學”，是指利用生物活性物質，通過體外培養或構建的方法，再造或者修復器官及組織的技術。這個概念由美國國家科學基金委員會在1987年提出，1988年將其正式定義為:應用生命科學與工程學的原理與技術，在正確認識哺乳動物的正常及病理兩種狀態下的組織結構與功能關系的基礎上，研宄開發用于修復、維護、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態的生物替代物的一門新興學科。
[0003]生物醫用材料(B1medical Materials)，亦可簡稱為生物材料(B1materials)，是用于對生物體進行診斷、治療、修復或替換病變組織、器官或增進其功能的新型高技術材料。而組織工程學的關鍵技術之一是用生物材料制備具有良好的生物相容性且可被肌體降解吸收的細胞支架。凝膠態是固體和液體的中間狀態，水凝膠是指能夠在水中發生溶脹并能保持大量水分而又不會溶解的親水交聯三維聚合物網絡。水凝膠是一類理想的生物材料，通過簡單的改性，可以得到與天然細胞外基質類似、令人滿意的物理和化學性質，同時對于氧氣、營養物質、細胞代謝物和水溶性金屬離子表現出良好的通透性。制備水凝膠的親水性高分子按來源分為天然高分子和合成高分子。天然水凝膠包括膠原、明膠、纖維蛋白、多糖等，人工合成水凝膠包括合成類多肽、PEG及其衍生物、PMMA及其衍生物、PLGA及其衍生物等。
[0004]透明質酸(Hyaluronic acid，HA)是糖胺聚糖中的一種，擁有良好的水溶性、生物相容性和降解性能，在促進細胞外基質的分泌和蛋白聚糖形成過程中發揮了重要的作用；然而，脆弱的物理機械性能以及在體內過快的降解速度限制了其應用前景。為了獲得具有理想物理機械性能和生物降解速度的天然高分子水凝膠，化學交聯的方式被廣泛的應用于制備過程中。化學交聯反應中經常應用到羧基、羥基、氨基等化學活性較高的官能團，常用的化學交聯劑一般含有雙官能團，比如二胺、二肼、二醛、二醇等，但這些交聯劑通常具有細胞毒性，如果殘留將影響水凝膠材料的生物相容性。需要研宄一種新型的化學交聯高分子水凝膠，來避免交聯反應中添加額外化學物質而帶來的細胞毒性。同時，現代醫學要求生物材料在使用中能夠具有可塑和可控性，實現微創的治療效果。
【發明內容】
[0005]針對上述問題，本發明提供了一種巰基/ 二硫鍵可控自交聯透明質酸水凝膠。所述水凝膠物理性質可控，具有良好的細胞相容性和生物降解性能，可用于組織工程原位損傷修復或用于構建可控吸收的三維細胞支架。
[0006]本發明通過以下技術方案來實現:
一種巰基/ 二硫鍵可控自交聯透明質酸水凝膠，以具有自由巰基的巰基-透明質酸化合物為原料，將原料溶解，然后通過巰基之間氧化反應形成穩定的二硫鍵，從而構建三維化學交聯的智能型水凝膠，通過調節巰基-透明質酸高分子聚合物表面巰基密度、凝膠溫度和透明質酸的分子量，利用巰基和二硫鍵之間的氧化還原轉變特性，從而控制凝膠的形成時間、降解時間以及力學特性，構建具有良好三維網絡交聯結構的可控智能型水凝膠。作為可選方式，所述三維化學交聯的反應條件為pH值7.4?8.0。在還原劑作用下，所述水凝膠中的二硫鍵可發生斷裂，凝膠結構迅速崩塌，降解為生物相容性良好的透明質酸單分子物質。
[0007]作為可選方式，具有自由巰基的巰基-透明質酸化合物是以透明質酸為原料，通過半胱氨改性得到的。
[0008]作為可選方式，所述透明質酸的分子量為:0.1MDa?1.0MDa0
[0009]作為可選方式，所述巰基-透明質酸化合物中的半胱氨接枝率為；10%?60% ； 作為可選方式，所述巰基-透明質酸化合物濃度為1~5% ;進一步的可以為1.0%或2.0%
或 3.0%。
[0010]通過調整透明質酸的分子量(0.1 MDa,0.3 MDaU MDa)、半胱氨的接枝率(11.28%、12.41%、14.69%,29.13%,33.54%,37.47%,51.47%,55.44%,60.56%)、巰基-透明質酸化合物的濃度(1.0 wt %、2.0 wt%或3.0%)、凝膠環境的溫度(4°C、37°C )，可以精確控制水凝膠形成的時間(從6分鐘到2小時以上)。
[0011]作為可選方式，所述水凝膠中的二硫鍵可在二硫蘇糖醇(DTT)或谷胱甘肽(GSH)等還原性小分子存在的條件下，使透明質酸之間的二硫鍵斷開，從而使水凝膠發生還原裂解。進一步的，所述還原性小分子的在體系中的濃度為0.通過調整透明質酸的分子量、半胱氨的接枝率、還原性小分子的濃度，可以控制水凝膠還原裂解的程度(從幾分鐘到幾小時)。
[0012]作為可選方式，所述水凝膠可通過模具成型為特定的形狀。
[0013]作為可選方式，所述水凝膠是可注射的，通過控制材料的凝膠時間或環境溫度，可使產品在注射前呈流體狀態，在注射后形成凝膠狀態。所述水凝膠具有可注射、可原位成膠、凝膠過程不產生或殘留含有細胞毒性物質等優點。所述水凝膠可以通過注射的方式植入體內，并在組織損傷部位形成水凝膠，實現組織損傷的原位修復。
[0014]本發明提供了一種基于具有自由巰基的巰基-透明質酸化合物的水凝膠成膠與裂解體系，所述水凝膠成膠與裂解體系包括上述的巰基/二硫鍵可控自交聯透明質酸水凝膠和還原性小分子。其成膠時間與裂解程度可根據應用需要靈活調整，該體系具有良好的細胞相容性，凝膠過程不產生具有細胞毒性的物質，無外源性物質的引入，有利于細胞的增殖；具有良好的生物降解性能，細胞本身產生的還原性物質也可加快二硫鍵降解，凝膠降解過程不產生具有細胞毒性的物質，有利于細胞基質的分泌和組織損傷部位的修復。
[0015]本發明還提供了一種上述的二硫鍵交聯的透明質酸水凝膠的制備方法，以透明質酸為原料，通過半胱氨改性得到具有自由巰基的巰基-透明質酸高分子聚合物(海綿狀固體)，將其溶解，然后通過巰基之間氧化反應形成二硫鍵，構建具有三維化學交聯結構的水凝膠。
[0016]作為可選，可將溶解后的巰基-透明質酸化合物置于相應的模具中進行凝膠反應以獲得特定形狀的水凝膠；也可以將溶解后的巰基-透明質酸化合物制成注射液，注射后使其在目標區域原位成膠。
[0017]作為可選方式，在上述制備方法中，以透明質酸為原料，通過半胱氨改性得到具有自由巰基的巰基-透明質酸高分子聚合物，將其溶解于PH=7.4的PBS緩沖液中，然后調節pH值至7.4?8.0，通過巰基之間形成二硫鍵的反應，形成三維化學交聯的水凝膠。
[0018]作為可選，采用加入IM的NaOH溶液的PH值。
[0019]作為可選方式，在上述制備方法中，具體包括以下步驟:
1)透明質酸的半胱氨改性:
半胱氨上的氨基與透明質酸上的羧基在N-琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)的催化下進行酰胺反應，制備出原料巰基-透明質酸化合物；
2)化學交聯:
將步驟I)中的制備的半胱氨改性透明質酸溶解，然后通過巰基之間形成二硫鍵的反應，形成三維化學交聯的水凝膠。
[0020]作為可選方式，在上述制備方法中，具體包括以下步驟:
1)透明質酸的半胱氨改性:
透明質酸鈉在N-琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸土卜
ΠΤΤ.(EDC.HCl)的催化下與半胱氨(CSH -HC1)鹽酸鹽反應，隨后加入二硫蘇糖醇(DTT)，反應結束后，在去離子水中透析，冷凍干燥，得到半胱氨改性透明質酸；
2)化學交聯:
將步驟I)中的制備的半胱氨改性透明質酸溶解于pH=7.4的PBS緩沖液中，然后通過疏
基之間形成二硫鍵的反應，形成三維化學交聯的水凝膠。
[0021 ] 在半胱氨改性透明質酸的制備過程中加入二硫蘇糖醇(DTT )可避免制備過程中部分半胱氨改性透明質酸發生二硫鍵交聯導致冷凍干燥后得到部分海綿狀產物無法在后續步驟中溶解。透析過程又可除去多余的二硫蘇糖醇(DTT)，避免其殘留在產物中影響后續步驟的效果。
[0022]作為可選方式，在上述制備方法中，所述步驟I)具體為:
將透明質酸鈉溶解于去離子水中，首先加入N-琥珀酰亞胺(NHS)，充分溶解；然后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDOHCl)粉體，用IM的NaOH和IM的HCl溶液調整反應液的pH=4.75，反應2個小時；隨后加入半胱氨(CSH*HC1)鹽酸鹽溶液，反應24個小時；最后用IM的NaOH溶液調整反應液的pH=8.5，加入二硫蘇糖醇(DTT)溶液，反應12個小時。
[0023]反應結束后，用IM的HCl溶液調整反應液的pH=3.0-3.5