一種具有提高學習記憶能力的多肽TAT-N-cad S3及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種具有提高學習記憶能力的多肽 TAT-N-cad S3及其應用。
【背景技術】
[0002] 在神經系統中，突觸是兩個神經元相連并傳遞信息的部位，突觸的形成和功能對 神經環路和大腦的高級功能至關重要。當神經沖動傳導至軸突末梢，到達突觸前，引起突觸 前遞質釋放，作用于突觸后受體，引起下游細胞內信號通路的激活，完成信號在神經元間的 傳遞。突觸的發生、成熟和可塑性對神經環路和神經系統的功能至關重要，其分子機制直接 關聯于學習記憶等大腦尚級功能，并在精神分裂癥、孤獨癥、帕金森氏癥和阿爾茲海默癥等 多種疾病的發病過程中起到關鍵作用。因此，研宄突觸功能的關鍵調節機制對于理解大腦 的工作原理以及尋求神經系統相關疾病的治療手段顯得尤為重要。
[0003] 細胞粘附分子（Cell adhesion molecules, CAMs)如神經型 1?粘素（N-cadherin) 在突觸的發育、突觸的靶向識別和突觸功能的穩定性中發揮了重要作用。神經型鈣粘素分 布在成熟突觸活性帶和致密斑周圍，一方面通過其胞內段與catenin家族的蛋白形成復合 體，連接細胞骨架，另一方面通過自身的各個結構域與突觸前后膜上的受體和通道結合，從 而調控受體分子的膜表達和功能等。然而，神經型鈣粘素的翻譯后調控機制卻知之甚少。
[0004] 蛋白激酶D(Protein kinase D, PKD)是一類在進化上高度保守的絲蘇氨酸蛋白激 酶，它屬于媽調蛋白激酶超家族（Calmodulin-dependent protein kinases，CaMKs)。在哺 乳動物中，PKD包含三個亞型：PKD1、PKD2和PKD3。PKDl是于1994年最先在人和小鼠中克 隆得到的亞型。在神經系統中，PKDl在神經元發育早期調控神經元極性的形成；在神經元 發育中期，PKDl參與樹突囊泡轉運和樹突分叉的調控。PKD蛋白在哺乳動物神經系統中的 高表達和高活性一直持續至神經系統發育晚期和成年之后。因此，探討PKDl對突觸發育和 功能的調節機制和對學習記憶能力的影響，為開發相應的提高記憶能力和治療AD等神經 退行性疾病的藥物提供了重要的理論基礎和實驗依據，已成為神經科學領域的研宄熱點。
【發明內容】
[0005] 本發明所用解決的問題是如何提高學習記憶能力。
[0006] 為解決上述問題，我們提供了 一種具有提高學習記憶能力的多肽，名稱為 TAT-N-cadS3,為如下 al)或 a2)或 a3):
[0007] al)氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽；
[0008] a2)氨基酸序列如序列表中序列1第10-23位所示的多肽；
[0009] a3)序列表中序列1的第14位、第16位和第17位的氨基酸殘基保持不變，al)或 a2)所示的多肽經過1至5個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有提高學 習記憶能力作用的衍生多肽。
[0010] 其中，序列表的序列1由23個氨基酸組成，序列表的序列1的第1-9位氨基酸 殘基組成將待轉運分子導入細胞內甚至是細胞核內的區域，該區域可以被具有相同作用 的其它序列替換；序列表的序列1的第10-23位氨基酸殘基構成可以抑制細胞內PKDl對 N-cadherin蛋白氨基酸序列第869位、第871位和第872位絲氨酸磷酸化的區域，其中，序 列表的序列1的第14位、第16位和第17位絲氨酸為PKDl的磷酸化位點。
[0011] 編碼所述TAT-N_cadS3的核酸分子也屬于本發明的保護范圍。
[0012] 以上任一所述"編碼所述TAT-N-cadS3的核酸分子"可為如下1)或2)或3)所示 的DNA分子：
[0013] 1)核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子；
[0014] 2)與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼所述 TAT-N-cadS3 的 DNA 分子；
[0015] 3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述TAT-N-cadS3的 DNA分子。
[0016] 含有編碼所述TAT-N-cadS3的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或轉基 因細胞系也屬于本發明的保護范圍。
[0017] 本發明還保護抑制細胞內PKDl對N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872 位絲氨酸磷酸化的物質的應用，可為如下Cl)或C2):
[0018] Cl)提尚學習記憶能力；
[0019] C2)制備提尚學習記憶能力的廣品。
[0020] 所述N-cadherin蛋白可如序列表序列4所示。
[0021] 所述抑制細胞內PKDl對N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872位絲氨酸 磷酸化的物質具體可為如下（Dl)、（D2)或（D3):
[0022] (Dl)所述 TAT-N_cadS3 ;
[0023] (D2)所述"編碼所述TAT-N-cadS3的核酸分子"；
[0024] (D3)含有編碼所述TAT-N_cadS3的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或 轉基因細胞系。
[0025] 本發明還保護一種產品，其活性成分為抑制細胞內PKDl對N-cadherin蛋白第869 位、第871位和第872位絲氨酸磷酸化的物質；所述產品的功能可為如下Cl)或C2):
[0026] Cl)提尚學習記憶能力；
[0027] C2)制備提尚學習記憶能力的廣品。
[0028] 所述N-cadherin蛋白可如序列表序列4所示。
[0029] 所述抑制細胞內PKDl對N-cadherin蛋白第869位、第871位和第872位絲氨酸 磷酸化的物質具體可為如下（Dl)、（D2)或（D3):
[0030] (Dl)所述 TAT-N_cadS3 ;
[0031] (D2)所述"編碼所述TAT-N-cadS3的核酸分子"；
[0032] (D3)含有編碼所述TAT-N_cadS3的核酸分子的表達盒、重組載體、重組微生物或 轉基因細胞系。
[0033] 以上任一所述產品可為藥物。
[0034] 以上任一所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0035] 所述轉基因細胞系、轉基因組織和轉基因器官均不包括繁殖材料。
[0036] 實驗證明，本發明提供的TAT-N-cad S3可提高學習記憶能力。給予了 TAT-N-cad S3 (干擾PKDl對N-cadherin磷酸化）的大鼠，其在水迷宮訓練階段表現為能更快找到隱藏 在水下的平臺，具有更強的學習記憶能力。
【附圖說明】
[0037] 圖1為體外磷酸化實驗以及Western blot結果。
[0038] 圖2為過表達N-cad mut對PKDl與N-cadherin結合能力的影響。
[0039] 圖3為過表達N-cad mut對N-cadherin細胞膜表面定位的影響。
[0040] 圖4為TAT-N-cadS3及對照肽TAT-N-cadS3A的氨基酸序列。
[0041] 圖5為在體外培養的皮層神經元中TAT-N-cadS3對PKDl與N-cadherin結合能力 的影響。
[0042] 圖6為在體外培養的皮層神經元中TAT-N-cadS3對N-cadherin細胞膜表面定位 的影響。
[0043] 圖7為水迷宮行為測試中四個象限和平臺的位置情況。
[0044] 圖8為TAT-N_cadS3對學習記憶能力的影響。
【具體實施方式】
[0045] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。本實施例中的定量實驗，如無特殊說明均設置三 次重復，結果取平均值。
[0046] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0047] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0048] 下述實施例中的Western blot結果采用Quantity One軟件進行灰度掃描。
[0049] 下述實施例中所用的液體配制方法具體如下：
[0050] 解剖液：蔗糖 7. 5g/L，葡萄糖 3. Og/L，NaC16. 8g/L，KC10. 4g/L，Na2HPO4 · 12H20 0· 24g/L，KH2P040. 03g/L，HEPES(Sigma 公司產品）2. 3464g/L ;溶劑為水；pH 為 7. 2-7. 4。使 用0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，于