一種對t細胞和造血干細胞具有高效感染和促增殖能力的慢病毒載體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于醫學生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種用于構建具有高效轉 染能力和表達高效生物活性的慢病毒載體方法。
【背景技術】
[0002] 隨著生物技術的發展，基因工程（genetic engineering)在醫學上的應用越來越 廣泛。基因工程是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段， 將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變 生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品的技術。基因工程技術為基因的結構和功能 的研宄提供了有力的手段。
[0003] 對于哺乳動物細胞的遺傳改造，需要使用合適的載體，將外源基因導入宿主細胞 中并實現其應有的功能。常用的載體包括慢病毒載體、腺病毒載體以及逆轉錄病毒載體等。 但是，仍然存在著感染效率低、實驗流程復雜的問題。因此，本領域技術人員致力于開發新 的感染效率高，且生物活性強的哺乳動物細胞遺傳改造技術。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種用于構建具有高效轉染能力和表達高效生物活性的 慢病毒載體方法及其應用。
[0005] 本發明的第一方面，提供了一種重組病毒包膜糖蛋白，所述蛋白具有式I所示的 結構：
[0006] N 端' B-A C 端'（I)
[0007] 其中，
[0008] 元件A為衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；
[0009] 元件B為輔助蛋白元件，并且所述輔助蛋白元件可特異性識別細胞膜表面蛋白；
[0010] 表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。
[0011] 在另一優選例中，所述病毒為慢病毒、腺病毒、或腺相關病毒。
[0012] 在另一優選例中，所述慢病毒為水皰口炎病毒。
[0013] 在另一優選例中，所述野生型病毒包膜糖蛋白為水皰口炎病毒包膜糖蛋白。
[0014] 在另一優選例中，所述元件A為VSVG (水皰口炎病毒糖蛋白）。
[0015] 在另一優選例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 2所示，優選地，所述元 件A的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0016] 在另一優選例中，所述細胞膜表面蛋白為表達于T細胞細胞膜表面的蛋白；優選 地，所述細胞膜表面蛋白選自：VLA-4、VLA-5、或其組合。
[0017] 在另一優選例中，所述細胞膜表面蛋白為表達于造血干細胞細胞細胞膜表面的蛋 白。
[0018] 在另一優選例中，所述元件B衍生自纖連蛋白、VCAM-I或其活性片段（能夠與 VLA-4和/或VLA-5特異性結合的多肽片段）。
[0019] 在另一優選例中，所述元件B選自：FN-P及其活性片段、CSl及其活性片段、或其組 合。
[0020] 在另一優選例中，所述元件B的序列如SEQ ID NO. :4、或SEQ ID NO. :6所示。
[0021] 在另一優選例中，所述元件B的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3、或SEQ ID NO. : 5所示。
[0022] 在另一優選例中，所述重組病毒包膜糖蛋白選自下組：
[0023] (i)具有SEQ ID NO: 19、21所示氨基酸序列的多肽；
[0024] (ii)具有與SEQ ID NO: 19、21所示氨基酸序列彡80%同源性（優選地，彡
[0025] 90 %的同源性；等優選地彡95 %的同源性；最優選地，彡97 %的同源性，
[0026] 如98%以上，99%以上）的多肽，且所述多肽具有與⑷中多肽相似的活
[0027] 性；
[0028] (iii)將（i)中任一所示氨基酸序列經過1-5個氨基酸殘基的取代、缺失或
[0029] 添加而形成的，且保留（i)中多肽活性的衍生多肽。
[0030] 在另一優選例中，所述重組病毒包膜糖蛋白具有選自下組的一個或多個特性：
[0031] a)具有特異性識別細胞膜表面蛋白的活性；
[0032] b)具有促進T細胞增殖的活性。
[0033] 本發明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發明第 一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白。
[0034] 本發明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發明第二方面所述的多核苷酸。
[0035] 在另一優選例中，所述載體中含有編碼式I所示結構的融合蛋白的多核苷酸序 列，
[0036] B-A (I)
[0037] 其中，
[0038] A為VSVG (水皰口炎病毒糖蛋白）蛋白元件；
[0039] B為輔助蛋白元件，并且所述輔助蛋白元件可特異性識別細胞膜表面蛋白；
[0040] 表示連接上述各元件的肽鍵或肽接頭。
[0041] 在另一優選例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO. : 2所示，優選地，所述元 件A的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0042] 在另一優選例中，所述細胞膜表面蛋白為表達于T細胞細胞膜表面的蛋白；優選 地，所述細胞膜表面蛋白選自：VLA-4、VLA-5、或其組合。
[0043] 在另一優選例中，所述元件B衍生自纖連蛋白或VCAM-1。
[0044] 在另一優選例中，所述元件B選自：FN-p及其活性片段、CSl及其活性片段、或其組 合。
[0045] 在另一優選例中，所述元件B的氨基酸序列如SEQ ID NO. :4、或SEQ ID NO. :6所 不O
[0046] 在另一優選例中，所述元件B的編碼多核苷酸序列如SEQ ID NO. :3、SEQ ID NO. : 5 所示。
[0047] 在另一優選例中，所述載體為質粒。
[0048] 在另一優選例中，所述載體為慢病毒載體、腺病毒載體、或腺病毒相關載體。
[0049] 本發明的第四方面，提供了一種基因工程化的重組病毒，所述病毒具有本發明第 一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白。
[0050] 在另一優選例中，所述病毒為慢病毒、腺病毒、或腺相關病毒。
[0051] 在另一優選例中，所述病毒的基因組中具有外源基因。
[0052] 在另一優選例中，所述外源基因包括表達CAR(嵌合抗原受體）的外源基因。
[0053] 在另一優選例中，所述病毒具有至少兩種權利要求1所述的重組病毒包膜糖蛋白 (優選為具有相同的元件A和不同的元件B)。
[0054] 在另一優選例中，所述病毒的包膜糖蛋白中具有SEQ ID NO: 19、和SEQ ID NO. :21 所示的氨基酸序列的多肽。
[0055] 本發明的第五方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發明第三方面所述的載體或 基因組中整合有本發明第二方面所述的多核苷酸。
[0056] 在另一優選例中，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞（如CHO細胞、NSO細胞、 或293細胞）。
[0057] 本發明的第六方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中包括本發明第一方面所述 的重組病毒包膜糖蛋白、本發明第二方面所述的多核苷酸、本發明第三方面所述的載體、本 發明第四方面所述的重組病毒、和/或本發明第五方面所述的宿主細胞。
[0058] 在另一優選例中，所述試劑盒中包括編碼本發明第一方面所述的重組病毒包膜糖 蛋白的載體；和，野生型載體，所述野生型載體編碼與所述重組病毒包膜糖蛋白相對應的野 生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
[0059] 在另一優選例中，所述試劑盒中包括本發明第四方面所述的重組病毒。
[0060] 本發明的第七方面，提供了本發明第一方面所述的重組病毒包膜糖蛋白、本發明 第二方面所述的多核苷酸、本發明第三方面所述的載體的用途，用于慢病毒、或腺病毒的包 裝。
[0061] 本發明的第八方面，提供了一種重組病毒的包裝方法，所述方法包括步驟：
[0062] (1)提供一包裝細胞；
[0063] (2)配制轉染體系，所述轉染體系中包括表達本發明第一方面所述的重組病毒包 月吳糖蛋白的載體；和
[0064] (3)轉染包裝細胞，進行病毒包裝。
[0065] 在另一優選例中，所述步驟（2)中，所述轉染體系包括至少兩種表達不同的重組 病毒包膜糖蛋白的重組型載體；優選地，所述轉染體系中還包括野生型載體，所述野生型載 體編碼與所述重組病毒包膜糖蛋白相對應的野生型病毒包膜糖蛋白或其片段。
[0066] 在另一優選例中，所述重組型載體為FN-p-VSVG，和/或CSl-VSVG ;所述野生型載 體為野生型載體H2。
[0067] 在另一優選例中，所述步驟（2)所述轉染體系中包括重組型載體
[0068] FN-p-VSVG，和CSl-VSVG ;以及野生型載體H2 ;優選地，所述重組型載體
[0069] (FN-p-VSVG和CSl-VSVG之和）與所述野生型載體的數量比為7 :3-6。
[0070] 在另一優選例中，所述重組型載體中FN-p-VSVG !CSl-VSVG為1 :1。
[0071] 在另一優選例中，所述包裝細胞為HEK-293T細胞。
[0072] 本發明的第九方面，提供了本發明第四方面所述的重組病毒的用途，用于制備生 產CAR-T細胞的試劑。
[0073] 本發明的第十方面，提供了一種制劑，所述制劑含有本發明第四方面所述的重組 病毒和任選的賦形劑。
[0074] 在另一優選例中，所述的制劑為藥物制劑。
[0075] 在另一優選例中，所述的賦形劑為藥學上可接受的賦形劑。
[0076] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0077] 圖1顯示了野生型H2質粒的結構圖譜。
[0078] 圖2顯示了經重組的FN-p - VSVG質粒的結構圖譜。
[0079] 圖3顯示了經重組的CSl-VSVG質粒的結構圖譜。
[0080] 圖4中A圖顯示了轉染體系中不同類型H2質粒配比對病毒產量的影響，B圖顯示 了成功表達的病毒顆粒的免疫印跡檢測結果。
[0081] 圖5顯示了本發明中經改造的慢病毒對T細胞的感染效率的檢測結果。
[0082] 圖6顯示了本發明中經改造的慢病毒能夠顯著的促進T細胞擴增。
[0083] 圖7顯示了本發明中經改造的慢病毒對不同類型的細胞均表現出了較高的感染 效率效率。
【具體實施方式】
[0084] 本發明人通過廣泛而深入的研宄，獲得一種能夠高效轉染哺乳動物細胞的技術， 實驗結果表明，該技術能夠提高病毒感染效率達30-70%，而且發明人意外地發現，使用本 發明的技術方案還能夠有效刺激T細胞的增殖，進而簡化CAR-T細胞治療的流程，降低成 本。
[0085] 在描述本發明之前，應當理解本發明不限于所述的具體方法和實驗條件，因為這 類方法和條件可以變動。還應當理解本文所用的術語其目的僅在于描述具體實施方案，并 且不意圖是限制性的，本發明的范圍將僅由所附的權利要求書限制。
[0086] 除非另外定義，否則本文中所用的全部技術與科學術語均具有如本發明所屬領域 的普通技術人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數值中使用時，術語 "約"意指該值可以從列舉的值變動不多于1%。例如，如本文所用，表述"約100"包括99 和101和之間的全部值（例如，99. 1、99· 2、99· 3、99· 4等）。
[0087] 雖然在本發明的實施或測試中可以使用與本發明中所述相似或等價的任何方法 和材料，本文在此處例舉優選的方法和材料。
[0088] 具體地，本發明涉及一種新型的慢病毒包膜質粒，可應用于慢病毒的包裝及哺乳 動物細胞的感染實驗，包括CAR-T細胞治療T細胞活化及感染實驗。目前常規實驗所使用 的慢病毒都是使用VSVG作為包膜糖蛋白的，但是該型包膜糖蛋白的慢病毒在感染一些難 感染的哺乳動物細胞時，效率較低。本發明中通過重組人纖連蛋白的細胞結合域或CSl功 能域，與VSVG融合表達，從而使新型的慢病毒獲得特異性靶向VLA-5、VLA-4抗原的能力，進 一步提高病毒感染效率。同時，重組的纖連蛋白還能刺激T淋巴細胞的增殖。在CAR-T細 胞治療T細胞活化階段，使用該新型慢病毒可在活化T細胞的同時即轉入外源基因，簡化實 驗流程，降低成本。而普通的慢病毒并無此功能。
[0089] 將纖連蛋白的細胞識別域與CSl功能域分別與慢病毒的包膜質粒H2的VSVG基因 融合表達，與載體質粒、輔助質粒Hl共轉染293T細胞，從而得到可靶向細胞表面的VLA-4、 VLA-5抗原的新型慢病毒顆粒。與傳統方法相比，可極大提高慢病毒感染哺乳動物細胞的效 率（可達30-70% )，此外還能促使T淋巴細胞成千上萬倍的增殖。
[0090] VSVG
[0091] 在本發明中，術語VSVG指水皰性口炎病毒糖蛋白，在本發明的一個優選的實施方 式中，所述VSVG的氨基酸序列如下：
[0092] MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNffKNVPSNYHYCPSSSDLNffHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQ ADG