一種溶血素融合蛋白PeLa-EK-10His-SLO及其表達質粒與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表達質粒與應用，屬于 醫學微生物或生物制藥領域。
【背景技術】
[0002] 化膿鏈球菌是一類常見的細菌，可引起皮膚、皮下組織的化膿性炎癥、呼吸道感 染、流行性咽炎的爆發性流行以及新生兒敗血癥、細菌性心內膜炎、猩紅熱和風濕熱、腎小 球腎炎等變態反應。
[0003] 化膿鏈球菌的溶血素（Str印tolysin 0, SL0)能夠與人及其它動物的細胞膜上 的膽固醇相結合，結合到細胞膜上的SLO蛋白會形成環狀寡聚體，形成大的孔道，導致細 胞膜溶解，另外，SLO具有極強的抗原性且易在體內殘留，刺激人體及其它動物產生抗體 (anti-SLO, AS0)，ASO集聚，導致變態反應。
[0004] SLO作為檢測試劑，可以用來檢測患者體內的ASO ;其次，可以作為治療腫瘤和殺 死腫瘤細胞的藥物，另外，SLO作為成孔蛋白，在動物基因工程和蛋白工程領域，用作動物細 胞轉基因和轉蛋白工具。
[0005] 目前SLO蛋白的基因工程重組技術主要存在以下缺陷：SLO蛋白對宿主具有毒性， 表達量低和生產過程中SLO檢測方法相對繁瑣。
【發明內容】
[0006] 本發明針對SLO重組蛋白對宿主具有毒性，表達量低和SLO蛋白檢測相對繁瑣的 問題，提供了一種溶血素融合蛋白PeLa-EK-IOHis-SLO及其表達質粒與應用。
[0007] 本發明的第一個目的是提供了 一種溶血素融合蛋白（PeLa-EK-IOHi s-SLO， PEHSL0)，該溶血素融合蛋白PEHSLO具有果膠酸裂解酶和溶血素蛋白活性；PHlSLO內部有 腸激酶的酶切位點，可以根據需要切除果膠酸裂解酶；另外，還含有10個組氨基酸序列，為 蛋白純化提供有效的親和基團。
[0008] 所述溶血素融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO. 1所示的序列。
[0009] 編碼所述溶血素融合蛋白的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,可在大腸桿菌 中高效表達溶血素融合蛋白PEHSL0。
[0010] 所述溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本發明的一種實施 方式中，如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] 所述npela-ek-10his-slo的核苷酸序列，在本發明的一種實施方式中，使用了曲 霉果膠酸裂解酶酶活性區Pela序列、大腸桿菌腸激酶位點序列、10個組氨基酸和化膿鏈球 菌溶血素 slo活性區與抗原區序列。而且曲霉果膠酸裂解酶酶活性區pela序列和化膿鏈 球菌溶血素 slo活性區與抗原區序列，依據大腸桿菌背景下的密碼子優化和增加蛋白表明 基團親水性等原理，進行了優化設計。
[0012] 本發明的第二個目的是提供一種表達所述溶血素融合蛋白PEHSLO或使用所述 npela-ek-10his-slo融合基因構建的表達質粒。
[0013] 所述質粒，在本發明的一種實施方式中，為npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0014] 本發明的第三個目的是提供一種表達所述溶血素融合蛋白PEHSLO的基因工程菌 或轉基因細胞系。
[0015] 所述基因工程菌，在本發明的一種實施方式中，以大腸桿菌BL21(DE3)為 宿主，pET-28a⑴為載體，表達核苷酸序列為SEQ ID NO. 2的溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo〇
[0016] 本發明的第四個目的是提供一種檢測溶血素 SLO的方法，所述方法是融合表達果 膠酸裂解酶和溶血素蛋白，通過檢測果膠酶活性定性和定量分析溶血素 SL0。所述融合表達 是融合表達編碼氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示的基因。
[0017] 本發明的第五個目的是提供一種提高SLO可溶性表達的方法。所述方法是以大腸 桿菌BL21(DE3)為宿主，pET-28a(+)為載體，表達核苷酸序列為SEQ ID NO. 2的溶血素融 合基因 npela-ek-10his-slo。
[0018] 本發明還要求保護所述溶血素融合蛋白PEHSLO在SLO蛋白生產、SLO檢測、SLO抗 體制品制備、抗癌藥物生產、基因工程或蛋白工程等領域的應用。
[0019] 本發明的有益效果：
[0020] (1)本發明設計并合成了溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo,構建了含該 npela-ek-lOhis-slo融合基因的表達質粒和含該表達質粒的工程菌，該工程菌可以表達溶 血素融合蛋白（PeLa-EK-10His-SL0，PEHSL0)。搖瓶發酵表達結果表明，溶血素融合蛋白 PEHSLO對宿主細胞毒性低，20°C條件下表達48h后，npela-ek-10his-slo工程菌0D600可 以達到2. 5,高于slo獨立表達的工程菌（0D600 :1.60);說明融合表達可以降低SLO蛋白對 宿主具有毒性。
[0021] (2)本發明的工程菌表達的溶血素融合蛋白PEHSLO同時具有果膠酶活性、溶血性 和SLO抗原性；該工程菌果膠酶產率為5. 6Unit/mL培養液，溶血酶產率為400000Unit/mL， 可溶性溶血素融合蛋白PEHSLO產率為I. 2mg/mL培養液，占到細胞總蛋白的30 %，相比slo 胞內獨立表達（可溶性目標蛋白占胞內蛋白的5% )，可溶性目標蛋白產量上升達400% ; 說明融合表達可以提尚SLO蛋白的表達量。
[0022] (3)在生產監控檢測方面，溶血素融合蛋白PEHSLO可以用果膠酶活性進行定性和 定量分析，一次果膠酶檢測所需時間為〇. 3h，檢測成本為0. 15元人民幣，避免使用免疫學 (一次檢測所需時間為l〇h，檢測成本為500. 00元人民幣）和溶血法檢測（一次檢測所需 時間為I. 〇h，檢測成本為0. 50元人民幣），相對于經測定免疫學和溶血法檢測，檢測時間分 別縮短9. 5h和0. 5h，檢測成本分別節省499. 85元和0. 35元人民幣，經測定IUnit果膠酶 活性對應于0. 2mg左右的蛋白量和7. OX IO4Unit溶血酶活性。本發明的方法可以簡便SLO 的檢測，縮短檢測時間、降低檢測成本。
【附圖說明】
[0023] 圖 1 :設計的 npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)質粒結構圖；
[0024] 圖 2 :npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)酶切鑒定圖；I. DNA Marker， 2. npela-ek-10his-slo/pET_28a，3. npela-ek-10his-slo/pET_28a (+)雙酶切；
[0025] 圖 3 :重組表達 Pela-EK-IOHis-SLO 的 SDS-PAGE 圖譜；1.蛋白 Marker， 2. npela-slo/pET28a(+)/BL21 (DE3)的胞內上清，3.純化的 Pela-EK-10His-SL0。
【具體實施方式】
[0026] 以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本 發明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊 所述的條件進行操作。
[0027] 實施例1溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo設計與表達質粒設計
[0028] 所述核苷酸序列使用了曲霉果膠酸裂解酶酶活性區pela序列、大腸桿菌腸激酶 位點序列、10個組氨基酸和化膿鏈球菌溶血素 Slo活性區與抗原區序列，而且曲霉果膠酸 裂解酶酶活性區pela序列和化膿鏈球菌溶血素 Sl0活性區與抗原區序列，依據大腸桿菌背 景下的密碼子優化和增加蛋白表明基團親水性等原理，進行了優化設計。在果膠酸裂解酶 酶pela序列的上游添加 Noc I位點序列，在果膠酸裂解酶酶pela序列下游加上腸激酶序 列、10個組氨酸序列和Nde I位點序列；Nde I位點序列下游，連接slo基因序列，slo下 游加上BamH I序列，構建的融合基因的具體核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其氨基酸序 列如SEQ ID N0.1所示，表達質粒npela-ek-10his-sl〇-pET-28a(+)的核苷酸序列如SEQ ID N0.3。npela-ek-10his-sl〇-pET_28a(+)質粒結構如圖 1 所不。
[0029] 本發明加入果膠酸裂解酶pela序列的目的，是利用該Pela蛋白在大腸桿菌中可 以高效表達出活性蛋白同時對宿主毒性低的優越性，提高SLO蛋白的可溶性，降低SLO蛋 白對宿主的毒性，同時提供一種低成本和短時間的目標蛋白檢測方法；加腸激酶序列的作 用是可以根據應用需要出發，提供切除果膠酸裂解酶Pela的便利；加入10個組氨酸序列， 是為了提供Ni-親和層析的親和基團，由于是加在二個蛋白基團之間，根據本本發明的需 要，10個組氨基，能保證有效結合，同時在40mM咪唑濃度下可以有效洗脫，不必使用常規的 500mM咪唑，可以減少成本。
[0030] 實施例2溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo中npela-ek-lOhis序列的合成與 克隆
[0031] 使用化學合成和Over-Lap PCR的方法合成血紅素融合基因 npela-ek-10his-slo 的 npela-ek-10his 部分（SEQ ID NO. 2 的 l_992bp)，合成 npela-ek-10his 片段，上游加 上Noc I位點，下游加上Nde I序列將合成的片段與PMD18T載體連接，轉化JM109,轉 化產物涂布含100g/mL氨芐青霉素的LB平板，經過37 °C培養過夜，得到單克隆轉化子 npela-ek-10his/PMD18T/JM109,經過菌落PCR鑒定，質粒酶切鑒定和測序鑒定，測定的序 列和設計序列完全相同。
[0032] 實施例3溶血素融合基因 npela-ek-10his-slo中slo序列的合成與克隆
[0033] 使用化學合成和Over-Lap PCR的方法合成血紅素融合基因 npela-ek-10his-slo 的slo部分（SEQ ID NO. 2的992-2483bp)，上游加上Nde I位點，下游加上BamH I序列， 將合成的slo基因與PMD18T載體連接，轉化JM109,轉化產物涂布含100g/mL氨芐青霉素的 LB平板，經過37°C培養過夜，得到單克隆轉化子slo/PMD18T/JM109,經過菌落PCR鑒定，質 粒酶切鑒定和測序鑒定，表明新合成的slo基因全長為1485bp，編碼495氨基酸，測定的序 列和設計序列完全相同，提取slo/PMD18T備用。
[0034] 實施例 4 npela-ek-10his-slo/pET_28a(+)表達載體構建
[0035] 用于實現融合基因在大腸桿菌中表達的載體是pET_28a(+)，但對構架有較 大改變，不使用pET-28a(+)的二個His-tag和Thrombin序列，將pET-28a(+)質粒和 npela-ek-10his/PMD18T用Noc I和Nde I切，酶切產物切膠回收，再用T4連接酶連接，連 接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，經過37°C培養過夜，挑選轉化子，通過菌落PCR鑒 定，質粒酶切鑒定（見圖2)和測序鑒定，保存鑒定的npela- ek-10hiS/pET-28a(+)E.C〇li JM109 菌，提取 npela-ek-10his/pET_28a(+)備用。將 npela-ek-10his/pET_28a(+)質粒和 slo/PMD18T用Nde I和BamH I切，酶切產物切膠回收，再用T4連接酶連接，連接產物轉化 E. coli JM109感受態細胞，在100g/mL卡那霉素的LB平板，經過37°C培養過夜，挑選轉化 子，通過菌