水貂綠膿桿菌ExoA-FliC嵌合蛋白疫苗的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種水貂綠膿桿菌疫苗，尤其涉及一種水貂 綠膿桿菌ExoA-FliC嵌合蛋白疫苗。
【背景技術】
[0002] 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，又稱綠膿桿菌，是一種條件性致病菌， 對外界環境適應能力很強，在潮濕環境下可以長期存活。綠膿桿菌能引起水貂發生急性傳 染病，以出血性肺炎和敗血癥為主要特征，發病急，死亡快，死前出現呼吸困難、鼻孔流出紅 色帶泡沫液體等癥狀，死后剖檢可見整個肺葉腫大并有彌漫性出血和敗血癥變化。常呈地 方性暴發流行，發病貂場死亡率在10%~50%，給養貂業造成了較大的經濟損失。
[0003] 目前，對綠膿桿菌感染的治療有抗菌素和免疫兩種治療方法。常用藥物替米考星、 阿奇霉素、卡那霉素治療效果不顯著，這是由于長期使用抗菌素治療水貂綠膿桿菌導致大 量耐藥菌株的產生，并破壞了動物機體中正常菌群，引起繼發感染，從而導致治療失敗。目 前已檢測出11型綠膿桿菌，因此單一價態的水貂綠膿桿菌疫苗不能滿足臨床免疫的需求。 傳統的全菌苗和亞單位疫苗均為細菌的某一成分的整體結構，如外毒素或鞭毛蛋白；副作 用明顯，如產生過敏反應，對水貂會造成嚴重的病理性損傷；而且制備方法煩瑣，費時、費 力、產量極低，純度更低。
[0004] 發明專利申請201210095852. 4公開了 "一種水貂綠膿桿菌蜂膠滅活疫苗及制備 工藝"。該申請公開了一種由兩種綠膿桿菌菌株制備的水貂綠膿桿菌蜂膠滅活疫苗。將所 述綠膿桿菌菌株接種培養基通氣擴增培養，收獲培養物滅活后按1:1比例混合，加蜂膠制 備水貂蜂膠綠膿桿菌二價滅活疫苗。該發明所述的綠膿桿菌蜂膠滅活疫苗為全菌苗，因此 極有可能產生副作用。如產生過敏反應，對水貂會造成嚴重的病理性損傷；而且制備方法煩 瑣，費時、費力、產量極低，純度更低。
【發明內容】
[0005] 針對目前水貂綠膿桿菌疫苗不能滿足臨床免疫需求的現狀，本發明提供了一種水 紹綠膿桿菌exoA-fliC嵌合蛋白亞單位疫苗并對其免疫效果進行評價。
[0006] 本發明的技術方案是：exoA_fIiC嵌合蛋白，序列為由SEQ ID NO: 2的氨基酸序列 和序列為SEQ ID NO: 1的核苷酸序列；所述exoA-fliC嵌合蛋白的編碼基因為水貂綠膿桿 菌exoA的I+II區與fliC的N端510bp ;所述嵌合蛋白能夠引起針對水紹綠膿桿菌的保護 性免疫。
[0007] 優選的是，所述exoA-fliC嵌合蛋白經糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化修飾。
[0008] 水紹綠膿桿菌亞單位疫苗，包含藥學有效量的exoA-fliC嵌合蛋白，所述疫苗能 夠引起針對水貂綠膿桿菌的保護性免疫，并且包含藥學上可接受的媒介物。所述疫苗中嵌 合蛋白的濃度為0. 350~0. 766mg/ml。
[0009] 所述疫苗中還含有蜂膠干物質，所述蜂膠干物質的含量為10~15mg/ml。所述蜂 膠干物質購買自濱州華宏生物制品有限責任公司。
[0010] 水紹綠膿桿菌exoA-f IiC嵌合蛋白經Western blot檢測，發現重組蛋白具有與水 貂綠膿桿菌全菌制的抗血清發生反應的能力，證明重組蛋白具有了良好的反應原性。
[0011] 術語"藥學上可接受的媒介物"意指任何合適的常用于藥物制劑的可接受的賦形 劑、佐劑、載體、稀釋劑。
[0012] 水貂綠膿桿菌亞單位疫苗，通過下述方法制備：向嵌合蛋白上清中加入蜂膠溶液， 使蜂膠干物質的含量為10~15mg/ml ;充分攪拌使其充分混合乳化，即得到exoA-fliC蛋 白亞單位疫苗。所述重組蛋白上清中蛋白濃度為0. 350~0. 766mg/ml。
[0013] 本發明的有益效果：
[0014] (1)本發明得到的水貂綠膿桿菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗經皮下接種6-8周齡 的BALB/c小鼠，免疫4次后，于免疫后72天至9周取血測抗體，誘導產生了較高水平的 exoA-fliC特異性IgG抗體，其IgGl/IgG2a比值亦顯著升高，明顯傾向于Th2型免疫應答。 經皮下接種4-6月齡的健康貂，接種21d后取血測綠膿桿菌抗體，免疫組綠膿桿菌抗體全 部為陽性，有效率達到100%，而對照組未檢測到抗體。本結果顯示制備的水貂綠膿桿菌 exoA-fliC基因工程亞單位疫苗可以引起水貂的免疫應答。
[0015] (2)本發明使用基因工程的方法制備水貂綠膿桿菌exoA-fliC嵌合蛋白疫苗，不 但安全性大大提高，而且制備過程省時、省力、產量高。
【附圖說明】
[0016] 圖1是實施例1中exoA-fliC融合基因擴增結果；
[0017] 圖2是實施例1中exoA-f IiC嵌合蛋白SDS-PAGE可溶性分析；
[0018] 圖3是實施例1SDS-PAGE法分析exoA-fliC嵌合蛋白的純度；
[0019] 圖4是實施例2中exoA-fliC嵌合蛋白的western blot分析；
[0020] 圖5是實施例5重組exoA-fliC嵌合蛋白亞單位疫苗免疫小鼠血清中特異性抗體 水平。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明。
[0022] 實施例1 :水紹綠膿桿菌exoA-fliC嵌合蛋白的表達及純化
[0023] 1、細菌基因組DNA的提取
[0024] 水貂綠膿桿菌山東分離株PASD01 (經PCR方法分型鑒定為鞭毛抗原基因 A型）過 夜培養5ml備用，取Iml菌液至滅菌I. 5ml的離心管中，8000r/min離心5分鐘，棄去上清， 用IOOul的雙蒸水重懸。沸水煮15分鐘，放在-20°C或-80°C冰柜反復凍融3次。5000r/ min離心5分鐘，收集上清，即為所提DNA。-20°C保存備用。
[0025] 2、引物設計和exoA基因、fliC基因的克隆、測序
[0026] (1)引物設計
[0027] 應用Primer 5. 0設計exoA(I區+11區）基因的上下游引物，根據銅綠假單胞菌 鞭毛蛋白8821型設計fliC基因的引物。在exoA基因的上游引物引入Bam HI酶切位點， 在fliC基因的下游引入Xho I酶切位點。引物序列分別是：
[0028] exoA 上游引物：5 ' -GGATCCGCCGAGGAAGCCTTCGAC-3 '
[0029] exoA 下游引物：5 ' -GTGTTGACGGTCAAGGCCATGCCGTCGCCGAGGAACTC-3 '
[0030] fliC 上游引物：5' -GAGTTCCTCGGCGACGGCATGGCCTTGACCGTCAACACCAAC-3'
[0031] fliC 下游引物：5' -CTCGAGTGTTCAGCGACTCTGCGCTCATCTC-3?
[0032] 下劃線分別是Bam HI、Xho I酶切位點；
[0033] (2) exoA基因和fliC基因的擴增
[0034] 首先，以上述提取的細菌基因總DNA為模板，進行PCR擴增。
[0035] 擴增 exoA基因與 fliC基因的反應體系為：10XPfu Buffer with MgS042+2.5 yL， d NTP 2 μ L，上游引物 0.5 μ L，下游引物 0.5 μ L，模板 I μ L，Pfu DNA Polymerase 0.5 μ L， 滅菌去離子水14. 0 μ L，40%的甘油3 μ L，DMS01 μ L。
[0036] 擴增exoA基因的PCR反應程序為：94°C預變性5min，94°C變性lmin，68. 2°C退火 1111；[11，72。(^延伸3111；[11，30。5^168,72。(^延伸20111；[11。
[0037] 擴增fliC基因的PCR反應程序為：94°C預變性5min，94°C變性lmin，57. 9°C退火 lmin，72°C延伸2. 5min，30cycles，72°C延伸20min。反應完畢后取5 μ L的反應產物，1 %的 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR效果。
[0038] (3) PCR產物回收
[0039] 灌制可上樣100 y L的1. 0%瓊脂糖凝膠，將PCR產物分別加入電泳上樣孔中，指示 劑迀移至適當位置時停止電泳，在365nm紫外光下切下含目的片段的凝膠，移入1.5ml EP 管中，稱取重量后，參照OMEGA公司的普通瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒說明書進行。
[0040] (4) exoA基因、fliC基因與T載體的連接
[0041] 將上述ex〇A，fliC基因片段膠回收產物進行加 A (Pfu高保真酶不可以自動加 A， 沒法連普通的T載體），反應體系為：Taq酶0.5 μ L，10 X Buffer 1 μ L，d ΝΤΡ0. 5 μ L，膠回 收產物8 μ L。反應程序：72°C 20min。
[0042] 將加 A后的產物分別連到pMD19-T Vector上，連接體系為：pMD19-T Vector luL，目的基因片段4yL，Solution I 5yL，4°C連接過夜。將連接產物導入到DH5a感 受態細胞中，涂布于含有〇. lmg/ml氨芐青霉素的LB培養基平板，37°C培養過夜；挑取單菌 落經菌液PCR及質粒酶切鑒定正確后測序，即得到插入序列正確的重組克隆載體，命名為 pMD19-T-exoA，pMD19-T-fliC。
[0043] 3、構建重組克隆載體 pMD19-T-exoA-f IiC
[0044]