高穿透性納米抗體融合蛋白制備及其在抗腫瘤中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物與新醫藥技術領域，特別涉及高穿透性納米抗體融合蛋白制備及 其在抗腫瘤中的應用。
【背景技術】
[0002] 在本發明作出之前，腫瘤的靶向治療研究是迄今提高腫瘤治療效果、減少藥物毒 副反應的最有效、最有實際應用潛力的措施之一。融合蛋白（重組蛋白）的構建和表達為 腫瘤靶向藥物的研發提供了方法。然而這類藥物只對一小部分（通常< 20% )腫瘤發揮作 用，通過個體化地檢查藥物療效相關生物標志，才能確定少數適宜用藥的患者，并且藥物發 揮理想抗腫瘤效應的前提不僅僅是設法讓藥物積聚于腫瘤局部，更重要的是要使藥物在腫 瘤局部獲得良好的穿透性，使其更多地進入腫瘤細胞而發揮作用。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的就在于克服上述缺陷，研究高穿透性納米抗體融合蛋白制備及其在 抗腫瘤中的應用。
[0004] 本發明的技術方案如下：
[0005] 高穿透性納米抗體融合蛋白，其主要技術特征在于：該蛋白由革巴向人EGFR納米抗 體和腫瘤穿透肽iRGD經由連接肽linker，即GGGGSGGGGSGGGGS連接組成。
[0006] 本發明的另一技術方案是：
[0007] 高穿透性納米抗體融合蛋白的制備方法，其主要技術特征在于它包括以下步驟： 通過設計三條引物在已保存有ant i-EGFR基因片段的載體PSJF2上進行聚合酶鏈式反應擴 增得到HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD基因片段，并克隆到表達載體pET-28a上，構建表達載 體pET-28a-ant i-EGFR-iRGD，并經過測序驗證，將其轉化入大腸桿菌BL21DE3表達菌，經過 異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導重組蛋白表達，通過鎳離子親和層析柱純化重組蛋白，可 得到聚丙烯酰氨凝膠電泳純95%，15mg/L細菌培養物的融合蛋白；
[0008] 上游引物Pl:
[0009] 5, -CATGCCATGGGCCATCACCATCACCATCACCAGGTAAAGCTGGAG-3'
[0010] 45bp
[0011] 下游引物P2:
[0012] 5 ' -CGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGTTCAGATCTTCTTCGCTGAT
[0013] 67bp
[0014] 下游引物P3:
[0015] 5 ' -CCCAAGCTTCTAGCAGTCCGGACCTTTGTCACCACGGCACGATCCGCCACCGCCAGAGCCACCTCC GCCTGAACCGCCTCCACC-3 '
[0016] 84bp
[0017] (1)重組人ant i-EGFR-iRGD基因片段擴增：
[0018] 選用上游引物Pl和下游引物P2,以已保存有ant i-EGFR基因片段的pSJF2 載體重組質粒為模板，聚合酶鏈式反應（PCR)擴增出Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker， 將此作為模板，再用上游引物Pl和下游引物P3進行PCR反應，得到Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III ；
[0019] (? ant i-EGFR-iRGD 表達載體 pET28a-ant i-EGFR-iR⑶的構建：
[0020] 將步驟⑴中獲得的ant i-EGFR-iR⑶目的基因 PCR產物純化回收，并將其與載體 pET28a連接，構建ant i-EGFR-iRGD表達載體pET28a-ant i-EGFR-iRGD，通過轉化入大腸桿 菌DH5 α，進行抗性篩選挑選連接成功的菌株，并用菌液PCR手段對表達載體進行鑒定，挑 選得到陽性克隆按照質粒小提試劑盒使用說明提取質粒并送測序驗證；
[0021] (3)將表達載體 pET28a-ant i-EGFR-iRGD 轉化至表達菌株 BL21DE3 :
[0022] 取已經確認的 100 μ g/ μ L表達載體pET28a-ant i-EGFR-iRGDO. 1 μ L-5 μ L 轉化入 氯化鈣制備的表達菌株BL21DE3感受態細胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑選陽性克 隆低溫冰箱內甘油保存該菌種；
[0023] (4)重組ant i-EGFR-iR⑶的誘導表達及純化：
[0024] 3)重組ant i-EGFR-iRGD異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導表達：
[0025] 對重組ant i-EGFR-iRGD用ImM異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導表達，在誘導4 小時后，聚丙烯酰氨凝膠全蛋白電泳；
[0026] 4)重組ant i-EGFR-iR⑶經AKTA Purifier900FPLC系統，鎳離子親和層析柱純化：
[0027] 收集1000 mL經過異丙基-β -D-硫代半乳糖苷誘導表達后的BL21DE3菌體，用 PBS、5mM咪唑重懸菌體，350W功率進行超聲破碎，12000r ·π?η-1離心后收集上清液于AKTA PurifieWOOFPLC系統純化，最后通過對純化的蛋白進行聚丙烯酰氨凝膠電泳，檢測蛋白，測 定純度；
[0028] (5) AXIMA MALDI-LNR-T0F驗證純化蛋白的分子量為18KD。
[0029] 本發明又一技術方案是：
[0030] 高穿透性納米抗體融合蛋白作為抗腫瘤藥物的應用，其主要技術特征在于高穿透 性納米抗體融合蛋白為活性成分用于治療腫瘤。
[0031] 所述腫瘤特別是指胃癌和胃轉移癌。
[0032] 所述適于經直腸、鼻內、肺部、陰道內、外部、口服或腸胃外，包括皮下、植入、靜脈 內和肌內給藥。
[0033] 本發明的有益效果是：融合蛋白的雙特異性靶向（EGFR和整合素 α νβ 3/β 5)可以 提高該融合蛋白的適應范圍，使藥物積聚于腫瘤局部，同時融合蛋白通過NRP-I途徑，使藥 物在腫瘤局部獲得良好的穿透性，使其更多地進入腫瘤細胞而發揮作用。
【附圖說明】
[0034] 圖1-Pl Ρ2 PCR得到的Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker基因片段瓊脂糖電泳圖：
[0035] 泳道 I :DL2000marker ;泳道 2 :PCR 結果（489bp)。
[0036] 圖 2-P1P3PCR 得到的 Nco I-HIS-ant i-EGFR-linker-iRGD-Hind III 基因片段 瓊脂糖凝膠電泳圖：
[0037] 泳道 I :DL2000marker ;泳道 2 :PCR 結果（528bp)。
[0038] 圖3-目的基因表達載體pET28a_ant i-EGFR-iRGD DH5 α菌體PCR電泳圖：
[0039] 泳道I :DL2000marker ;泳道2 :陽性對照（同圖2泳道2);泳道3 :1號菌PCR結 果；泳道4 :2號菌PCR結果；泳道5 :3號菌PCR結果；泳道6 :4號菌PCR結果；泳道7 :5號 菌PCR結果；泳道8 :6號菌PCR結果。
[0040] 圖4-表達載體pET28a-ant i-EGFR-iRGD中Nco I和Hind III之間的測序結果 示意圖。
[0041] 圖 5-BL21 DE3-pET28a-ant i-EGFR-iRGD 蛋白可溶性表達與純化：
[0042] 泳道1 :未誘導；泳道2 :誘導；泳道3 :沉淀；泳道4 :上清；泳道5 :純化蛋白（星 標出）；泳道6 :Marker。
[0043] 圖6--鎳柱親和層析純化目的蛋白圖譜（流速：5MI/min ;A液：1*PBS PH7. 4 ;B 液：1*PBSPH7.4，1M咪唑，箭頭指示目的蛋白）。
[0044] 圖 7-AXIMA MALDI-LNR-T0F 檢測結果示意圖。
[0045] 圖8--胃癌細胞株EGFR表達情況示意圖。
[0046] 圖9--免疫熒光分析示意圖。
[0047] A ant i-EGFR 組 FITC 熒光；B ant i-EGFR-iRGD 組 FITC 熒光；C EGFR 單克隆抗體 組 FITC 熒光；D ant i-EGFR 組 Hochest 染色；E ant i-EGFR-iR⑶組 Hochest 染色；F EGFR 單克隆抗體組 Hochest 染色；G ant i-EGFR 組 FITC 與 Hochest 融合；H ant i-EGFR-iR⑶組 FITC與Hochest融合；I EGFR單克隆抗體組FITC與Hochest融合。
[0048] 圖10--ant i-EGFR-iR⑶融合蛋白對BGC823胃癌細胞的體外抑制作用：
[0049] 對于西妥昔單抗橫坐標0.5以]?、14]\1、2 4]\1、4 4]\1、8 4]\1、16 4]\1分別指7.5 4 8/1^、 15 μ g/mL、30 μ g/mL、60 μ g/mL、120 μ g/mL、240 μ g/mL。
[0050] 圖11--ant i-EGFR-iRGD融合蛋白的小鼠體內抗腫瘤作用。
【具體實施方式】
[0051] 本發明技術思路是：將編碼抗人EGFR抗原的單域抗體和腫瘤穿透肽iRGD的核苷 酸序列連接起來，得到編碼ant i-EGFR-iRGD的融合基因片段，并將其插入原核表達質粒載 體。發明還涉及了能夠表達融合蛋白的宿主細胞，該融合蛋白能在大腸桿菌中高效表達，及 在抗腫瘤中的應用。
[0052] 以下結合【具體實施方式】詳細說明，但不限制本發明。
[0053] 具有抗腫瘤作用的融合蛋白的表達和純化過程如下：
[0054] 1、重組人ant i-EGFR-iRGD基因片段擴增：
[005