植物耐逆性相關蛋白GmNF-YA15及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種植物耐逆性相關蛋白GmNF-YA15及其編 碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫嚴重制約著大豆的生長、發育。因此，了解大豆對逆 境條件的應答與信號傳導機制，提高大豆品種的抗逆性，成為大豆遺傳研究及品種改良的 重要任務之一。
[0003] 在逆境脅迫下植物體內會產生一系列應答反應，伴隨著許多生理生化及發育上的 變化。明確植物對逆境的反應機制，將為抗逆基因工程研究和應用提供科學論據。目前，植 物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學和遺傳工程研究相結合，探索用生 物技術來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應能力。
[0004] 在干旱、高鹽和低溫等環境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平 上做出相應的調整，以最大程度上減少環境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘 導表達，這些基因的產物不僅能夠直接參與植物的脅迫應答，而且能夠調節其它相關基因 的表達或參與信號傳導途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環境的抗性。與脅 迫相關的基因產物可以分為兩大類：第一類基因編碼的產物包括離子通道蛋白、水通道蛋 白、滲透調節因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等）合成酶等直接參與植物脅迫應答的基因產物； 第二類基因編碼的產物包括參與脅迫相關的信號傳遞和基因表達調節的蛋白因子，如蛋白 激酶、轉錄因子等。其中，轉錄因子在植物脅迫應答的基因表達調控中起著重要作用。
[0005] 轉錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區域中順式作用元件發 生特異性作用的DNA結合蛋白，通過它們之間以及與其它相關蛋白之間的相互作用，激活 或抑制轉錄。轉錄因子的DNA結合區決定了它與順式作用元件結合的特異性，而轉錄調控 區決定了它對基因表達起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等 作用的影響。
[0006] 目前已知在植物中與脅迫相關的轉錄因子主要有：具有AP2結構域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯應答兀件結合蛋白，ethylene responsive element binding protein)轉錄因子家族、含有堿性區域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region/leucine zipper motif transcription factors)類轉錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY 轉錄因子家族、結合CCAAT-box的主要核轉錄因子的CBF (CCAAT binding factor)類轉 錄因子、含有堿性螺旋-環-螺旋（bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇（Trp cluster)的MYB家族。這些轉錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應外，其 它四個家族均參與調節植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應。NF-Y是一類結合順 式作用元件CCAAT-box的轉錄因子，特異的識別并結合許多真核生物組成型、誘導性和細 胞周期依賴性基因的啟動子或增強子中的順式作用元件CCAAT-box，進而在轉錄水平調 控這些基因的表達。NF-Y是由NF-YA、NF-YB和NF-YC三個不同亞基組成的雜合三聚體。 NF-YB和NF-YC的組蛋白折疊基序（HFM)相互作用使之形成二聚體，然后結合NF-YA形成 異源三聚體的NF-Y復合物，從而結合CCAAT-box，調節其靶基因的轉錄。NF-YA至少有兩 個結構域用于蛋白質的結合：富含谷氨酰胺的結構域（Q-rich domain)和一個亞基相互作 用的結構域（subunit interaction domain)。NF-YB也有兩個蛋白結合的結構域：組蛋白 折疊基序（histone-fold motif)和 TATA 結合蛋白（TATA-binding protein)結合結構域 (TBP-binding domain)。NF-YC有三個蛋白質的結合結構域：組蛋白折疊基序，TBP結合結 構域以及富含谷氨酰胺的結構域。NF-YA和NF-YC的結構氨基酸序列與組蛋白折疊基序同 源，NF-YB與H2B組蛋白折疊基序相關，而NF-YC于H2A組蛋白折疊基序相關，該基序由三 個α螺旋和兩個環組成，負責H2A/H2B二聚體的形成。
[0007] 目前，在植物中關于NF-Y轉錄因子的功能的報道較少，都在干旱脅迫中起重要的 作用（Nelson et al，2007XNelson等認為，與擬南芥AtNF-YBl轉錄因子同源的ZmNF-YB2， 在缺水的條件下過表達ZmNF-YB2的轉基因玉米可以明顯增強抗旱性，由于ZmNF-YB2可 以是多個與植物干旱有關參數發生改變，包括葉綠素含量、氣口導度、葉片溫度、減少萎 蔫和維持光合作用，從而提高抗旱性（Nelson, Peter P. Repetti, Tom R. Adams, Jingrui Wu, 2007)。Wen-Xue Li, Youko Oono等的研究證實，AtNF_YA5的表達受到干旱和ABA處理 的誘導。對其啟動子GUS分析表明部分誘導反應發生在轉錄水平。NF-YA5有一個靶位點 miR169,在干旱條件下，miR169表達受到抑制。NF-YA5在微管組織和保衛細胞有很高的表 達，因此，利用一個關鍵性轉錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的抗逆性，已 經成為植物抗逆基因工程的研究熱點。
【發明內容】
[0008] 本發明的一個目的是提供一種植物耐逆性相關蛋白GmNF_YA15及其編碼基因。
[0009] 本發明提供的蛋白質，為結合CCAAT-box的核轉錄因子蛋白，名稱為GmNF_YA15， 來源于大豆屬大豆（Glycine max L·)，是如下（a)或（b):
[0010] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0011] (b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
[0012] 序列表中序列1的氨基酸殘基序列是由217個氨基酸殘基組成的蛋白質，自氨基 端第123 - 148位氨基酸殘基序列為與NFYB/C互作區域，自氨基端第162 - 188位氨基酸 殘基序列為可能的核定位信號區，自氨基端第123 - 183位氨基酸殘基序列為保守的NF-YA 結構域。
[0013] 為了使a)中的GmNF_YA15便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組 成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
[0014] 表1.標簽的序列
[0015]
[0016] 上述1)中的GmNF-YA15可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得 至|J。上述1中的GmNF-YA15的編碼基因可通過將序列表中序列2的自Y末端第150-803 位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿 基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0017] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發明保護的范圍。
[0018] 上述DNA分子，為如下1) -5)中任一種DNA分子：
[0019] 1)編碼區為序列表中序列2所示的的DNA分子；
[0020] 2)編碼區為序列2自5'末端第147至803位核苷酸所示的DNA分子；
[0021] 3)編碼區為序列2自5'末端第150至803位核苷酸所示的DNA分子；
[0022] 4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性和/或抗氧 化性相關蛋白的DNA分子；
[0023] 5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性和/或抗 氧化性相關蛋白的DNA分子。
[0024] 上述嚴格條件可為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65oC下雜交，然后用 2 X SSC, 0· 1%SDS 和 I X SSC, 0· 1%SDS 各洗膜一次。
[0025] 含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護 的范圍。
[0026] 上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體，得到表達上述蛋白質的載體。
[0027] 可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體 包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基 因的3'端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3'端，如農桿菌冠癭瘤誘導 (Ti)質粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因（如大豆貯存蛋白基因）3'端轉錄的非 翻譯區均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前 可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動子、玉 米的泛素啟動子（Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使 用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這 些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀 框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可 以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于 對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在 植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因（GUS基因、螢光素酶基因等)、 具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等）或是抗化學試劑標記基因 (如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆 境篩選轉化植株。
[0028] 在本發明的實施例中，表達載體為YEP-GAP，對應的重組載體為 YEP-GAP-GmNF-YA15，YEP-GAP-GmNF-YA15為將上述DNA分子插入YEP-G