一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo82及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于真菌免疫調節蛋白領域，特別涉及一種草菇免疫調節蛋白FIP-VV082 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 利用大型真菌（蘑菇）及其活性物質治療人類疾病在亞洲國家有著悠久的歷史， 可以追溯到公元前3000年，由于其在免疫調節和抗癌方面的出色表現，近十年來在西方國 家也逐漸受到重視。過去對于大型真菌活性物質的研宄多集中在多糖和三萜，對于蛋白質 的研宄相對較少，但隨著生物技術在藥物研宄和開發中的應用，特別是對中草藥中基因、蛋 白和藥理作用之間關系研宄的逐漸深入，真菌蛋白逐步得到了重視，其中真菌免疫調節蛋 白（Fungal immunomodulatory protein，FIP)，由于其具有廣泛的免疫生物活性，而備受國 內外關注。
[0003] 真菌免疫調節蛋白（Fungal immunomodulatory protein，FIP)是從高等擔子菌中 分離得到的一類具有免疫調節活性的小分子蛋白質，其結構與功能與植物凝集素和免疫球 蛋白重鏈可變區相似，具有促進淋巴細胞增殖、調控細胞周期、誘發細胞凋亡、影響細胞因 子的表達、活化細胞粘附分子和抗過敏反應等免疫調節作用，擁有良好的臨床應用前景和 藥用保健價值。自1989年，日本人Kino從靈芝（Ganoderma Iucidum)子實體中分離到第一 個真菌免疫調節蛋白，命名為Ling Zhi-8 (LZ-8)，并對其基因序列，氨基酸順序和免疫生理 活性進行了測定。到目前為止，共有8種FIPs被分離純化出來，它們來自于靈芝（Ganoderma lucidium)，松杉靈芝（G. tsugae)，紫芝（G. japoncium)，小孢子靈芝（G. microsporum)，甜 靈芝（G.sinense)拱狀靈芝（G.fornicatum)，金針葫（Flammulina velutipes)和草葫 (Volvariella volvacea)，分別被命名為 LZ-8 (FIP-glu)，FIP-gts，FIP-gja(AY987825)，FI P-gmi, FlP-sin, FIP-gfo，FIP-fve 和FIP-vvo,共同組成了一個新的蛋白質家族 _ FIPs。在 FIPs家族中除了金針菇免疫調節蛋白（FlP-fve)和草菇免疫調節蛋白（FIP-vvo)以外，其 他的FIPs都是從不同種靈芝中分離得到的，這說明雖然都是靈芝但由于種類的不同，而具 有不同的免疫調節蛋白，甚至同種靈芝中就存在多種免疫調節蛋白。例如葉波平等從靈芝 (G. microsporum)中分離到3個蛋白質：LZP-l、LZP-2和LZP-3。體外實驗表明3種靈芝蛋 白具有較強的促進淋巴細胞增殖活性，而且SDS-PAGE表明其分子量與LZ-8不同，所以他們 獲得了 3種新的靈芝免疫調節蛋白。這樣的情況同樣發生在草菇中。除了 1997年Hsu，H. C.等人在草菇子子實體中通過分離純化和驗證，并經過直接氨基酸測序得到由112個氨基 酸組成的分子量約為12. 67KDa的一種草菇免疫調節蛋白（FIP-vvo)以外，還有可能存在其 它種草菇免疫調節蛋白。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種草菇免疫調節蛋白FIP-vvo82及其制備 方法，通過比較基因組等生物信息學方法篩選到一種同樣來源于草菇，但基因序列和氨基 酸序列都不同于FIP-vvo的具有免疫調節作用的免疫調節蛋白FIP-vvo82,其適用于在保 健品和醫藥中使用。
[0005] 本發明提供了一種草菇免疫調節蛋白FIP-W082,所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。該草菇免疫調節蛋白FIP-wo82全長113個氨基酸，理論分子量為12. 66kDa。
[0006] 本發明還提供并合成了編碼上述草菇免疫調節蛋白FIP-VV082的基因。該基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] 本發明通過一對引物 FIP-vvo82-F(NdeI5'-CAT ATG TCT ACC GAT TTG A-3'）和 FIP-vvo82-R(EcoRI5'-CTT AAG TTA TTC CAT TTC GCA-3'）。用基因克隆的方法得到了這 一草菇免疫調節蛋白FIP-VV〇82的基因序列，DNA全序列分析結果表明，FIP- VV〇82基因全 長 338bp。
[0008] 該蛋白屬于一種草菇免疫調節蛋白。將其cDNA序列在GenBank中進行BLAST 比對，沒有發現與其相似的基因序列，而將其氨基酸序列在NCBI的無冗余蛋白序列數 據庫（nr)中進行BLAST比對發現，該蛋白與來源于平蓋靈芝（G. applanatum)、赤芝 (G. Iucidum)和小孢子靈芝（G.microsporum)免疫調節蛋白的相似性達到60%，與金針葫 (F. velutipes)免疫調節蛋白FIP-fve為53%。說明FIP-vvo82是一種新的真菌免疫調節 蛋白，其編碼的基因是一個新的基因。并為此編碼此蛋白的基因改造和在各種外源基因表 達系統中高效表達提供優良的基因資源。
[0009] 本發明還提供了包含上述草菇免疫調節蛋白FIP-VV082基因的重組載體，優先選 為pET-28b (+)。將本發明的草菇免疫調節蛋白FIP-VV〇82基因插入到表達載體合適的限制 性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最 優選的方案，優選為將草菇免疫調節蛋白FIP- VV〇82基因插入到pET-28b (+)上的EcoRI和 NdeI限制性酶切位點之間，得到重組大腸表達質粒pET-FIP-vv〇82。
[0010] 本發明還提供了包含了上述草菇免疫調節蛋白FIP-VV082基因的重組菌株，優選 為重組菌株BL21-FIP-vvo82。
[0011] 本發明還提供了一種制備草菇免疫調節蛋白FIP-VV〇82的方法，包括以下步驟：
[0012] 1.上述重組載體轉化宿主細胞，得到重組菌株；
[0013] 2.培養重組菌株，誘導重組草菇免疫調節蛋白FIP-VV〇82的表達；
[0014] 3.超聲破碎獲取所表達的草菇免疫調節蛋白FIP-VV〇82。
[0015] 其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)細胞，優選將重組表達質粒轉化 大腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21-FIP-VV〇82。運用基因工程手段來產業化生 產草菇免疫調節蛋白FIP- VV〇82產品還未見報道。本發明首次提供了一個真菌免疫調節蛋 白FIP-VV〇82,可作應用于保健品和醫藥等工業。根據本發明的技術方案就可以實現利用基 因工程手段生產草菇免疫調節蛋白FIP- VV〇82。
[0016] 本發明利用生物信息學的方法，在草菇基因組中發現了一種與已知草菇免疫調節 蛋白（FIP-vvo)差異性達到25%即相似性為75%的新的草菇免疫調節蛋白FIP- VV〇82及 其編碼基因序列。并利用分子生物學和生物工程技術，構建高效表達這種草菇免疫調節蛋 白的工程菌株，利用超聲破碎得到重組草菇免疫調節蛋白FIP- VV〇82,對其進行了免疫學功 能鑒定。本發明不僅豐富了 FIPs的種類，而且為深入開展全新草菇免疫調節蛋白的開發及 應用奠定基礎。
[0017] 有益效果
[0018] 根據本發明的對機體具有免疫調節作用的真菌免疫調節蛋白及其基因序列，可以 制備出提高人體免疫力的保健食品，防治由于免疫力下降所導致的疾病的危害。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明的草菇免疫調節蛋白FIP-VV〇82在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE分 析；其中，1為表達載體蛋白；2為分子量標準；3為重組菌株蛋白BL21-FIP- VV〇82。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0021] L細胞株：Jurkat細胞。
[0022] 2.試劑盒、酶類、生化試劑和儀器：
[0023] 試劑盒：ELISA KIT 96T Human IL-2試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。 96孔培養板，血球計數板。
[0024] PCR引物合成和基因測序均由上海生工生物公司完成。
[0025] 酶類：內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。
[0026] 儀器：離心機；振蕩搖床；顯微鏡；酶標儀。
[0027] 生化試劑：氨芐青霉素，卡那霉素，青霉素，鏈霉素，胎牛血清（FBS)。
[0028]