疏水作用層析提純口蹄疫滅活病毒抗原的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及疫苗抗原分離純化領域，具體地，涉及一種從細胞培養液中分離純化口蹄疫滅活病毒疫苗抗原的色譜分離方法。
【背景技術】
[0002]口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus, FMDV)引起的烈性傳染病，主要感染對象為牛、羊、豬等偶蹄類動物，非偶蹄類動物也會被感染，但癥狀相對較輕。口蹄疫疫情往往會給畜牧業帶來了巨大的損失。由于口蹄疫傳染性強、傳播速度快、危害性大，自20世紀初開始，口蹄疫一直是國際衛生界關注的焦點，各國紛紛建立研宄機構以找到控制口蹄疫的方法。一直到19世紀末，口蹄疫病毒才真正被人類被發現。
[0003]最早關于口蹄疫病毒疫苗是法國Vall6e、Carr6等人于1926年發明的，他們已經測試了甲醛對于不同口蹄疫病毒滅活的作用，并最終通過在20°C用0.5%的甲醛滅活病毒4-7天，將滅活的病毒作為疫苗，達到了較好的保護水平。截止到今天，常用的口蹄疫疫苗依然是基于化學方法滅活的口蹄疫病毒，首先通過搖瓶或懸浮法大規模的培養幼倉鼠腎細胞(BHK-21細胞)，之后將活的口蹄疫病毒接種到細胞中，再將病毒收獲后濃縮、化學試劑滅活，與緩沖液和佐劑混合后制成口蹄疫疫苗。
[0004]隨著科學技術的發展，人們對疫苗的質量要求也越來越高。目前口蹄疫苗存在主要兩個問題:1.免疫保護力不穩定，免疫后檢測不到抗體或產生抗體的水平低，或者免疫期較短；2.安全性差，副反應強，表現為動物在注射疫苗后出現減食，停食甚至死亡等情況。其主要原因是現有的口蹄疫疫苗制備工藝多為傳統方法，純化工藝簡單，細胞培養液及宿主細胞中的多種雜質及過敏性物質并未除去，且抗原含量較低。這一現狀對我國口蹄疫疫情的控制及獸用疫苗產業的發展帶來極大影響。
[0005]口蹄疫滅活病毒抗原主要是146S，其純化方法主要包括聚乙二醇沉淀，超濾除雜，雙水相萃取等。這些方法難以獲得高純度的口蹄疫疫苗抗原。蔗糖密度梯度離心法能獲得高純度的口蹄疫滅活病毒，但這種方法不僅成本高，且難以應用于工業化生產。
[0006]色譜技術是一種易于工業放大，且能進行精度純化的技術。目前色譜技術已經用于多種人用疫苗及蛋白質藥物的分離純化，但在獸用疫苗領域應用尚較少。最近有專利報道采用凝膠過濾的方法來純化口蹄疫病毒抗原(內蒙古必威安泰生物科技有限公司.口蹄疫純化疫苗及其制備方法和應用.中國發明專利:CN 102988970 B，2014-06-18.)。凝膠過濾處理量小，料液的進料量僅為凝膠過濾柱體積的1/10，而且經過凝膠過濾后抗原的濃度會進一步下降，這些都是本領域研宄人員都知曉的有關凝膠過濾存在的問題。這些問題導致加工時間長，材料成本高，而且抗原在長時間的加工中也容易失去免疫活性。
[0007]本發明涉及一種適合于大規模從細胞培養液中提純口蹄疫滅活病毒抗原的方法。該方法通過口蹄疫病毒表面的疏水基團和疏水作用色譜填料上的疏水基團之間的相互作用，將口蹄疫滅活病毒抗原吸附在色譜柱上，從而與溶液中的雜質分開。采用溫和的洗脫條件就可以把吸附在色譜柱上的口蹄疫滅活病毒抗原洗脫下來，達到提純的目的。該方法速度快，操作步驟少，工藝穩定，口蹄疫滅活病毒抗原收率高，且易于放大于工業化規模生產，具有較大的實際應用價值。
【發明內容】
[0008]本發明的目的在于提供一種從細胞培養液中分離純化口蹄疫病毒抗原146S，同時具有高抗原收率的純化方法。
[0009]本發明的目的通過如下技術方案實現:
[0010]1.本技術發明的主要原理是根據疏水相互作用提純口蹄疫滅活病毒抗原，以疏水作用色譜為工具，通過口蹄疫滅活病毒抗原表面的疏水基團與疏水作用色譜填料上的疏水基團之間的相互作用，實現口蹄疫滅活病毒抗原在色譜填料上的吸附，從而與原料溶液中不發生吸附和吸附較弱的雜質分開，采用溫和的洗脫條件就可以把吸附在色譜柱上的口蹄疫滅活病毒抗原洗脫下來，達到提純的目的；
[0011]2.這種疏水作用色譜的模式可以是將疏水作用色譜填料加入到含有口蹄疫滅活病毒抗原的細胞培養液中，然后再將填料裝入色譜柱中進行色譜操作，或者是將含有口蹄疫滅活病毒抗原的細胞培養液直接加入到裝有疏水作用色譜填料的色譜柱中進行色譜操作；
[0012]3.所采用的疏水作用色譜填料表面的疏水基團為丁基(Butyl)、丁硫基(Butyl-S)苯基(Phenyl)或辛基(Octyl)；
[0013]4.細胞培養液中的口蹄疫滅活病毒抗原146S的濃度為2-100yg/ml ;為縮短色譜操作時間，可以采用截留分子量為50?300kDa的超濾膜對原料液進行超濾濃縮，以減少細胞培養液的體積；超濾時膜表面的切向流速為10?lOOcm/s，操作壓力在0.3MPa以下；
[0014]5.在進行疏水色譜分離之前，調節含有口蹄疫滅活病毒抗原的細胞培養液的電導為50?150mS/cm，pH為7.2?9.0 ;調節調節電導所用的鹽為硫酸銨、氯化鈉、磷酸鹽，優選的為硫酸銨；
[0015]6.色譜操作包括疏水作用色譜填料的平衡、進料、淋洗、洗脫和填料的再生。具體可以將(5)所得的口蹄疫滅活病毒抗原物料進料至預先平衡的裝有丁基(Butyl)、丁硫基(Butyl-S)苯基(Phenyl)或辛基(Octyl)的疏水色譜柱中。經淋洗后，進行洗脫，收集洗脫峰進行146S抗原及蛋白濃度的檢測；或將(5)所得物料與預先平衡的疏水色譜填料混合后再裝入色譜柱中，再進行淋洗和洗脫操作。
[0016]7.上述平衡和淋洗所用的溶液的電導為30?300mS/cm，優選的為50?150mS/cm，pH 7.2?9.0 ;洗脫液的電導為5_150mS/cm，pH 7.2?9.0 ;調節調節電導所用的鹽為硫酸銨、氯化鈉、磷酸鹽，優選的為硫酸銨；疏水作用色譜填料再生所用的溶液為0.5?IMNaOH或20?40wt %異丙醇。
[0017]本發明具有以下特點:
[0018](I)抗原活性回收率尚，最尚可達90% ；
[0019](2)純化工藝操作步驟少，步驟間銜接緊湊；
[0020](3)避免使用超速離心等價格昂貴的設備，成本相對較低；
[0021](4)易于放大到工業化規模生產。
[0022]綜上所述于，本發明提供了一種簡便、快速、易于放大的分離純化獲得高收率的口蹄疫病毒抗原的方法，具有較大的實際應用價值。
【附圖說明】
[0023]圖1為實施例1中，疏水色譜純化口蹄疫病毒抗原色譜圖；
[0024]圖2為實施例1中的SDS-PAGE電泳圖，I為細胞培養液上清，2為疏水色譜收集的組分；
[0025]圖3為實施例1中，經過純化后的口蹄疫病毒抗原高效液相凝膠過濾色譜檢測結果O
【具體實施方式】
[0026]本發明的方法通過以下實施例進行詳細說明。
[0027]實施例1
[0028]取100mL含口蹄疫病毒的細胞培養液上清，總蛋白濃度為0.47g/L，口蹄疫病毒抗原濃度為2.1 μ g/mL。
[0029]使用截留分子量為300kDa的板式超濾膜(Sartorius)將細胞上清液一次濃縮到20mL左右，樣品中蛋白濃度為lOOyg/mL左右；超濾時膜流速為lOOcm/s，壓力控制在
0.3MPa 以下。
[0030]在上清液中依次用硫酸銨和氫氧化鈉溶液分別調至電導率和pH，使電導率至100mS/cm以上，pH 8.0左右。然后進料到預先用硫酸錢調至電導100mS/cm的磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)平衡的 Butyl Sepharose 4FF 疏水色譜柱(GE Healthcare, 5cmX 1.6cm 1.D.)，進料后經繼續淋洗后，依次用硫酸銨調至電導為70mS/cm的磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)和5mS/cm磷酸鈉緩沖液(pH 8.0)分別洗脫，收集洗脫峰。色譜圖見圖1。色譜填料采用0.5M氫氧化鈉溶液再生。
[0031]分別檢測洗脫峰組分的抗原濃度及總蛋白濃度，最后得到146S抗原相對于細胞上清液的收率為92%，純化倍數為8.8，并對所得純化的樣品進行SDS-PAGE