一種檢測cpt1b基因突變的引物及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種檢測CPTlB基因突變的引物、方法和試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 肉毒喊掠桐醜轉移酶 IB (Carnitine Palmitoyltransferase IB, CPT1B)位于骨骼· 肌細胞線粒體外膜上，是脂肪酸氧化的第1個限速酶，能夠催化從酰基輔酶A將酰基轉移至 L-肉毒堿而形成酰基肉毒堿的反應，在長鏈脂肪酸從細胞漿轉運到線粒體進行氧化的過程 中起重要作用。CPTlB基因全長10610個核苷酸，定位于22ql3. 33染色體上，含有18個編 碼外顯子，編碼772個氨基酸肽鏈。CPT-IB基因突變引起CPT-IB功能缺陷，肉堿依賴的轉 運系統功能將遭到破壞，從肌肉細胞漿轉運到線粒體的長鏈脂肪酸減少，長鏈脂肪酸不能 被氧化，故血清游離脂肪酸增高，肌肉組織中大量脂肪聚集，從而引起一系列生化紊亂。
[0003] 目前僅發現3種與疾病相關的CPTlB基因突變，主要為錯義突變，也包括1種內含 子與外顯子交界區的剪切點突變。
[0004] 對于CPTlB基因突變的檢測通常為針對某一個突變進行檢測，尚未有關于利用多 個特異性引物對CPTlB基因多個突變同時進行測定的報道。
【發明內容】
[0005] 針對上述現有技術，本發明的目的是提供一種檢測CPTlB基因突變的引物和試劑 盒。
[0006] 本發明的另一目的是提供一種非診斷目的檢測CPTlB基因的全部編碼外顯子及 外顯子/內含子交界區突變的方法。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0008] 一種檢測CPTlB基因突變的引物，包括擴增CPTlB基因18個編碼外顯子及外顯子 /內含子交界區的引物，其引物序列如SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 26所示，具體如下：
[0009] CPTlB-Pl-F :5' - ACGCACGGACAGGAGTGAAC-3, ；（SEQ ID NO. 1)
[0010] CPTlB-Pl-R :5' - CTCTCCTGATGCCCTGCTGT-3' ；（SEQ ID NO. 2)
[0011] CPT1B-P2-F :5' - AGGAGCCAGTTCCCAAGACT-3' ；（SEQ ID NO. 3)
[0012] CPT1B-P2-R :5' - TGGCTGCTGTCCTGTATCTG-3' ；（SEQ ID NO. 4)
[0013] CPT1B-P3-F :5' - TTGTCTTAGCCCTACATCCG-3' ；（SEQ ID NO. 5)
[0014] CPT1B-P3-R:5' -GAAACCAACCAGCAACTCC-3' ；（SEQ ID N0.6)
[0015] CPT1B-P4-F :5' - AGGGTCTCAGGGAGTTGCT-3' ；（SEQ ID NO. 7)
[0016] CPT1B-P4-R :5' - CCACCATGACTTGAGCACC-3' ；（SEQ ID NO. 8)
[0017] CPT1B-P5/6-F :5' - TAAGGGCTTGAGAATAATGG-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0018] CPTlB-P5/6-R:5' -GACAATTCCCTGGTTATGGT-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0019] CPT1B-P7/8-F :5' - AGATTGGTCCTTGGGTCAGC-3' ；（SEQ ID NO. 11)
[0020] CPT1B-P7/8-R :5' - AGCAGGACTCCCTTCACCAT-3' ；（SEQ ID NO. 12)
[0021] CPT1B-P9-F :5' - CTTCCCTGCTTCTGACACTG-3' ；（SEQ ID NO. 13)
[0022] CPT1B-P9-R :5' - CCCGTCAGAGGTAGGTTATG-3' ；（SEQ ID NO. 14)
[0023] CPT1B-P10-F :5' -GCAGCAGGACAGCCAGCATA-3' ；（SEQ ID NO. 15)
[0024] CPT1B-P10-R :5' - TGCGTCAGCCTTCCGACTAG-3' ；（SEQ ID NO. 16)
[0025] CPT1B-P11/12-F :5' -GGGCAACAGAGCAAGATTC-3' ；（SEQ ID NO. 17)
[0026] CPT1B-P11/12-R:5' -GAAGCCAGTTTGGACTCTAC-3' ；（SEQ ID NO. 18)
[0027] CPT1B-P13/14-F :5' -GGCTTCAGGGAGGACAGAG-3' ；（SEQ ID NO. 19)
[0028] CPT1B-P13/14-R :5' - CAGGCAGACAGGAGGCAGA-3' ；（SEQ ID NO. 20)
[0029] CPT1B-P15-F :5' -GCCAGGGCTACTCTTCACC-3' ；（SEQ ID NO. 21)
[0030] CPT1B-P15-R:5' -GTAGGAGGGCAGTGGGACA-3' ；（SEQ ID N0.22)
[0031] CPT1B-P16-F :5' - TTTGTCCCACTGCCCTCCTA-3' ；（SEQ ID NO. 23)
[0032] CPT1B-P16-R :5' - CAGGGAGGTATTTGGGATGG-3' ；（SEQ ID NO. 24)
[0033] CPT1B-P17/18-F :5' - TTCTTCACCCTTCTTGTTGC-3' ；（SEQ ID NO. 25)
[0034] CPT1B-P17/18-R:5' -GAAGGTTCTGAGGCAAGTAT-3' ；（SEQ ID N0.26)
[0035] 其中，F為正向引物，R為反向引物。
[0036] CPTlB基因編碼外顯子5和6、7和8、11和12、13和14、17和18位置較近，故分別 設計一對引物即 P5/6、P7/8、P11/12、P13/14、P17/18，分別如SEQIDN0·9-SEQIDN0·10、 SEQ ID NO. Il-SEQ ID NO. 12,SEQ ID NO. 17-SEQ ID NO. 18,SEQ ID NO. 19-SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 25-SEQ ID NO. 26 所示。
[0037] 本發明還提供了一種檢測CPTlB基因突變的試劑盒，該試劑盒中含有擴增CPTlB 基因18個編碼外顯子及外顯子/內含子交界區的引物。
[0038] 本發明所述的試劑盒還包括用于PCR擴增反應的酶和試劑。
[0039] 用于PCR擴增反應的酶和試劑包括Taq酶、dNTPUOXPCR緩沖液和雙蒸水。
[0040] 進一步的，所述試劑盒中還包括用于提取樣品DNA的試劑。
[0041] 本發明還提供非診斷目的檢測檢測CPTlB基因的全部編碼外顯子及外顯子/內含 子交界區突變的方法，包括如下步驟：
[0042] (1)提取待測樣本DNA ;
[0043] (2)以樣本DNA為模板，用擴增CPTlB基因18個編碼外顯子及外顯子/內含子交 界區的引物進行PCR擴增，得到擴增產物；
[0044] (3)采用測序引物對擴增產物進行測序擴增，得到測序擴增產物；
[0045] (4)對測序擴增產物進行測序，并與數據庫中正常的CPTlB基因序列進行比對，從 而確定CPTlB基因的突變位點。
[0046] 步驟（2)中，PCR擴增的條件為：94°C預變性3min 20s，94°C變性35s，退火35s，特 異性擴增引物的退火溫度為52°C -59°C，72°C延伸50s，共30個循環；最后72°C延伸5min。
[0047] 步驟⑶中，所述測序引物為PCR擴增引物對中的正向引物。
[0048] 步驟（3)中，測序擴增反應的條件是：95°C預變性120s，95°C變性30s，50°C退火 10s，60°C延伸120s，共25個循環。
[0049] 測序擴增反應體系采用IOyL,具體組成為：DNA模板1 μ L、引物（正、反向）各 1 μ L、BDT2 μ L、雙蒸水補足至總體積10 μ L。
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