一種庫蚊沃爾巴克氏體的熒光檢測引物及其檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種庫蚊沃爾巴克氏體的熒光檢測引物及 其檢測方法和檢測試劑盒。
【背景技術】：
[0002] 沃爾巴克氏體（Wolbachia)是廣泛分布于節肢動物體內的共生微生物，它可能是 昆蟲共生微生物中最為豐富的類群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗 翅目等昆蟲種類中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩定地存在于 宿主的生殖細胞內，通過卵細胞傳遞給宿主子代，并可通過多種方式如細胞質不親和、雌性 化和殺雄性等調控宿主的生殖活動。通過這些調控作用促進其在宿主種群內廣泛傳播。
[0003] 在沃爾巴克氏體（Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細胞質不親和 (Cytoplasmic Incompatibility，Cl)是最常見的一種類型。它表現為當被沃爾巴克氏 體（Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類Wolbachia的雌雄蚊交配時，精 子和卵子結合后胚胎無法發育。沃爾巴克氏體（Wolbachia)的胞質不親和的特性可導致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進行種群壓制和種群替 代。它的應用對蚊媒病防治具有巨大的價值。近期研宄發現，沃爾巴克氏體（Wolbachia) 不僅具有上述的特性外，同時它還能在蚊子體內與蚊子攜帶的一些重要的病原生物（如 登革病毒，瘧原蟲等）相互作用，抑制它們在蚊子體內的增值和擴散從而在阻斷這些病原 生物傳播于人類。沃爾巴克氏體（Wolbachia)的這種抑制作用與它在蚊子體內組織的分 布相關，所以，了解沃爾巴克氏體（Wolbachia)在蚊子體內組織分布有助于快速篩選出傳 播阻斷效果最好的沃爾巴克氏體（Wolbachia)感染的蚊子，也有助于監測沃爾巴克氏體 (Wolbachia)在蚊群中的垂直傳播，同時也有利于高效率地監測大規模大地域范圍的沃爾 巴克氏體（Wolbachia)在蚊子組織中的感染情況。
[0004] 在自然界中，蚊子的種類有很多，常見的有伊蚊和庫蚊兩種。伊蚊分為白紋伊蚊和 埃及伊蚊，其中埃及伊蚊不攜帶沃爾巴克氏體。由于沃爾巴克氏菌只能存活于宿主體內，不 能在體外自由生活，因而如何有效特異地檢測沃爾巴克氏菌是對該細菌研宄的必備工具。 比較常用的檢測手段有聚合酶鏈反應法（PCR法）和免疫染色法。免疫染色法耗時耗力，而 且特異性不好。隨著PCR方法的普及，針對沃爾巴克氏體的檢測有了很大的進步。不同蚊 種攜帶不同的沃爾巴克氏體，通過PCR結果能夠直觀的看出蚊子攜帶的不同沃爾巴克氏體 類型，這樣為我們的日常檢測提供了很大的便利。目前針對不同沃爾巴克氏體PCR檢測的 方法還不完善。
【發明內容】
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[0005] 本發明的目的是提供一種專一性強、特異性高和靈敏度高的庫蚊沃爾巴克氏體的 熒光檢測引物。
[0006] 本發明的庫蚊沃爾巴克氏體的熒光檢測引物，其特征在于，包括：
[0007] wPipF:5' -GTTTGTGCAGCTAATAG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示）；
[0008] wPipR:5' -GTCTGCAAGGCCTATTTCTACTG-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示）；
[0009] 探針：5'-CTTTCAATTGAAAAGATTCGATCAAC-3'（其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 所 示）；
[0010] 探針的兩端分別結合有熒光發生基團和熒光淬滅基團。
[0011] 所述的熒光發生基團為FAM，所述的熒光淬滅基團為BHQl。
[0012] 本發明的第二個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的庫蚊沃爾巴克氏體 的檢測方法，其特征在于，提取樣品DNA，以該樣品DNA為模板，使用上述庫蚊沃爾巴克氏體 的熒光檢測引物中的wPipF和wPipR，以及探針，進行熒光定量PCR擴增，擴增反應完成后， 根據探針標記的熒光發生基團的熒光信號，讀取并記錄樣品的PCR循環次數Ct，根據樣品 的Ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品是否含有庫蚊沃爾巴克氏體。
[0013] 所述的進行熒光定量PCR擴增，其反應條件優選為：預變性50°C 5分鐘，95°C 15分 鐘；擴增94°C 15秒、55°C 45秒，40個循環；55°C的時候收集熒光信號。
[0014] 本發明的第三個目的是提供一種庫蚊沃爾巴克氏體的檢測試劑盒，包括熒光檢測 引物，其特征在于，
[0015] 所述的熒光檢測引物為：
[0016] wPipF: 5' -GTTTGTGCAGCTAATAG-3' ；
[0017] wPipR:5'-GTCTGCAAGGCCTATTTCTACTG-3' ；
[0018] 探針：5' -CTTTCAATTGAAAAGATTCGATCAAC-3' ；
[0019] 探針的兩端分別結合有熒光發生基團和熒光淬滅基團。
[0020] 所述的熒光發生基團為FAM，所述的熒光淬滅基團為BHQl。
[0021] 利用本發明的熒光檢測引物和探針按照本發明的檢測方法能夠快速高效專一的 檢測出庫蚊沃爾巴克氏體，具有專一性強，特異性高（只檢測出庫蚊沃爾巴克氏體，而伊蚊 沃爾巴克氏體不發生擴增），靈敏度高，其最低檢測限為lOOcopies/ml。
[0022] 因此，本發明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便等優點。
【附圖說明】：
[0023] 圖1是庫蚊沃爾巴克氏體的靈敏度的實驗結果圖，其中DNA抽提液、10X、100X、 1000 X分別代表DNA抽提液、10 X、100 X、1000 X倍梯度稀釋的DNA抽提液；
[0024] 圖2是庫蚊沃爾巴克氏體的重復性的實驗結果圖，其中I、11分別代表實施例2中 兩只蚊子中的庫蚊沃爾巴克氏體的基因組DNA的熒光定量PCR結果；
[0025] 圖3是庫蚊沃爾巴克氏體的特異性的實驗結果圖，其中的六條曲線分別代表六只 蚊子中的沃爾巴克氏體的基因組DNA的熒光定量PCR結果。
【具體實施方式】：
[0026] 以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0027] 實施例1 :靈敏度
[0028] 1、一只廣州致倦庫蚊（攜帶庫蚊沃爾巴克氏體）經二氧化碳熏暈后，解剖腹部置 于0. 2ul EP管中；
[0029] 2、加入 20ul DNA 提取液（DNA 提取液的配方為：30mM Na0H、0. 25mM EDTA、 15mMTris-HCl，溶劑為水，下同，使用前需振蕩，將白色片狀物一同加入）；
[0030] 3、充分混勻；
[0031] 4、離心后，99°C溫浴10分鐘；
[0032] 5、DNA抽提液-20°C保存，獲得庫蚊沃爾巴克氏體的基因組DNA ;
[0033] 6、將上述含有庫蚊沃爾巴克氏體的基因組DNA的DNA抽提液進行10、100、1000倍 梯度稀釋作為模板DNA，每個梯度有兩個平行，共8個樣本；
[0034] 7、PCR擴增體系：
[0035] 模板0嫩2以1、10\了&911^11緩沖液5 4 1、5臟〇1/1]\%(：12 4 4 1、2.5111〇1/1(1階138 2 μ 1、20 ymol/L 探針（5, -CTTTCAATTGAAAAGATTCGATCAAC-3'）1 μ 1、20 ymol/L 熒光檢測 引物 wPipF(5' -GTTTGTGCAGCTAATAG-3'）1 μ 1、20 ymol/L 熒光檢測引物 wPipR(5' -GTCTGC AAGGCCTATTTCTACTG-3'）1 μ 1、0· 55U UNG 酶 0· 2 μ 1、2· 5U/ μ I Taq 聚合酶 3 μ 1，去離子水 10. 8 μ 1〇
[0036] 8、混勻離心后進行PCR擴增；
[0037] 9、PCR反應條件：
[0038] 預變性 5(TC 2min
[0039] 95 °C 15min
[0040] 擴增 94°C 15s
[0041] 55°C 45s 40個循環，55°C時收集熒光
[0042] 10.擴增結束后觀察擴增曲線。
[0043] 具體結果如圖1所示，結果判斷標準：