一種預測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的試劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種預測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的試劑,更具體的說 是通過測定與AMD相關基因 VEGF-A的多態性預測受試者對于雷珠單抗治療年齡相關性黃 斑變性的易感性,該方法可用于指導年齡相關性黃斑變性雷珠單抗的個體化治療,屬于生 物技術領域。
【背景技術】
[0002] 年齡相關性黃斑變性(Age-related macular degeneration,AMD)是西方 50 歲以 上人群致盲的首要原因,研宄發現AMD可能與紫外線照射、微量元素缺乏等有關,但具體病 因仍不清楚。國內的調查顯示,年齡相關性黃斑變性發病率為15. 5%,其發病率隨著年齡的 增加而增加。隨著人口老齡化的到來,年齡相關性黃斑變性已經成為我國老年人致盲的首 要原因。主要表現是患者視物變形、視力下降、眼前黑影遮擋,眼底表現是出血、滲出,嚴重 者視力完全喪失,進而嚴重危害老年人的生活質量。
[0003] AMD屬多基因疾病,具有明顯的遺傳傾向,雖然通常認為遺傳與環境因素在AMD發 病中起主導作用,但確切的病因與發病機制仍不清楚。
[0004] 研宄發現,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是 導致年齡相關性黃斑變性(AMD)脈絡膜新生血管(CNV)形成的關鍵因子,抗VEGF藥物雷珠 單抗能夠結合血管內皮生長因子A (VEGF-A)所有亞型,有效抑制CNV的生長及滲漏,但仍有 25. 8 %患者治療后最終視力低于基線視力。
[0005] 目前進行AMD遺傳病因研宄,多采用SNP作為基因組標志的關聯分析方法,是有效 的。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性,在人群中的頻率 需>1%,SNPs是雙等位基因標記,這種單堿基變化中有70. 1 %為同型堿基之間的轉換:如 G/A或T/C,29. 1 %為發生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C (胞嘧啶)是人類基因組中最易發生 變化的位點,因為大多數是甲基化胞嘧啶,能夠自發脫氨基轉換為T(胸腺嘧啶),SNP包含 了已知多態性的80-90%,是最常見的遺傳變異。
[0006] 由于生存的選擇壓力導致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。 SNPs在基因非編碼區的數量是編碼區的4倍,總數可達3百萬個。SNP以其密度高(平均 每Ikb就有1個)、代表性強(位于基因內部的SNP可能直接影響蛋白質結構或表達水平)、 遺傳穩定性好(同微衛星多態性比較而言)、易于自動化分析(因 SNP在人群中多為雙等位 基因標記,可簡單以"+/ -或1/0"直接分型)等特點成為很好的遺傳標志。
[0007] 目前國外多選取WAMD易感基因研宄其與雷珠單抗療效的相關性。有報道研宄藥 物治療的靶基因及其通路VEGF及VEGFR變異與雷珠單抗療效的相關性,但結論不一致。目 前尚無任何關于VEGF-A基因 rs3025018T>G位點與雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效 相關的研宄結果。
【發明內容】
[0008] 本發明的主要目的是提供一種預測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的方 法。
[0009] 本發明的第二個目的是提供一種預測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的 試劑,包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。
[0010] 為實現上述目的,本發明采用以下技術方案:
[0011] 一種預測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的方法,通過提取宿主細胞的基 因組DNA,測定受試者的VEGF-A基因第6內含子rs3025018T>G位點的基因型,預測受試者 對雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性的療效;VEGF-A基因第6內含子區rs3025018T>G位 點的基因型為GT時,受試者對雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性的療效較好;攜帶G等位 基因時,受試者對雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性的療效較好。
[0012] 本發明提供了一種分離核酸,具有SEQ ID No. 1所示的堿基序列,其+501位即是 變異位點,以字母"B"標示出。該核酸序列為VEGF-A基因全長序列。圖1為VEGF-A基 因結構及其多態性變異位點的示意圖,附圖中包含有7個外顯子,rs3025018T>G位點標在 VEGF-A基因圖中第6內含子區的相應位置。
[0013] 本發明提供了一組檢測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的特異性引物,具 有SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的堿基序列,長度均為20bp,而且可以特異性地擴增出 包含有SEQ ID No. 1所示序列中+501位置的產物。
[0014] 本發明提供了一種檢測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的診斷試劑盒,其 中含有本發明特異性擴增VEGF-A基因+501位點的引物對和用于PCR擴增檢測的試劑盒的 常規組件、試劑、緩沖液等,本領域技術人員熟知這些常規組件和檢測方法。本發明試劑盒 中的全部組分、含量、來源和使用方法如下:
[0015] -種檢測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的診斷試劑盒,含有SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的特異性引物。
[0016] -種檢測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的診斷試劑盒,由以下試劑組 成:
[0017] 30 μ L 10 X PCR 緩沖液;
[0018] 5 μ L濃度為IOmM的dNTP混合液;
[0019] 5 μ L濃度為2U/ μ L的TaqDNA聚合酶;
[0020] 2. 5 μ L 濃度為 IOpM/ μ L 的 Fl 引物;
[0021] 2. 5 yL濃度為 IOpM/yL 的 Rl 引物;
[0022] 235 μ L 純水。
[0023] 所述Fl引物具有SEQ ID No. 2所示的堿基序列;Rl引物具有SEQ ID No. 3所示 的堿基序列。
[0024] 使用方法:
[0025] 1)PCR擴增:通過PCR擴增VEGF-A基因的第6內含子區部分片段,制備混合液: 10XPCR 反應緩沖液 3 μ L,10mM/L dNTP 0· 5 μ L,TaqDNA 聚合酶 0· 5 μ L,10pM/L 上游引物 0. 5yL,10pM/L下游引物0. 5yL,基因組DNA 2yL,加純水至30yL。PCR反應條件為95°C 預變性5min,95°C變性30s,60°C退火30s,72°C延伸25s,總共35個循環,72°C總延伸2min。 PCR前于每一體系中加入20 μ L的石蠟油,以防止液體揮發。
[0026] 2)基因型判定:將PCR產物直接測序,根據熒光信號的差異判定基因型。
[0027] 本發明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA,樣品來源無限制,如:體液(血 液、腹水及尿液等)、組織細胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組 DNA。調整基因組DNA的濃度,使其盡可能的一致。以基因組DNA為模板,可擴增出含VEGF-A 基因突變位點的核酸片段,以獲取測定的大量樣本。這種通過擴增含VEGF-A基因變異點的 DNA片段獲得的樣品,特別適于用作測定材料。
[0028] 在進行基因輔助診斷時,本發明優先適用于測定根據VEGF-A基因的突變類型 存在的輔助診斷試劑,輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑,其對應于用于測定 VEGF-A基因突變類型的方法。按采用的測定方法來選擇適當的特定試劑,如DNA片段和/ 或用于PCR擴增步驟的引物。
[0029] 本發明的優點是:本發明首次闡明了 VEGF-A基因多態性位點與雷珠單抗治療年 齡相關性黃斑變性療效相關性,提供了一種預測雷珠單抗治療年齡相關性黃斑變性療效的 方法,該方法可用于指導年齡相關性黃斑變性雷珠單抗的個體化治療。
[0030] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步敘述,以便公眾對
【發明內容】
有更 深入的了解,并非對本發明的限制,凡依照本發明公開內容所做的任何本領域的等同替換, 均屬于本發明的保護范圍。
【附圖說明】
[0031] 圖1為VEGF-A基因結構