一種紅曲菌代謝產物的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域。涉及天然活性產物的制備。
【背景技術】
[0002]紅曲是我國的傳統發酵產品，在我國一直被認為具有藥用和食用雙重功效，不僅是祖國寶貴的科學文化遺產，而且在世界微生物史上具有重要意義。20世紀30年代，自紅曲流傳到了歐美以后，世界各國都開始研宄紅曲菌的分類與鑒定、紅曲色素的提取工藝優化及其在生產中的應用，并對紅曲發菌酵組分的分離純化、結構表征及代謝機理等方面進行了一些研宄，但進展較慢。最近幾十年，隨著微生物學的發展、分析方法的進步和分析儀器的更加精確，國內外的學者對紅曲菌的發酵進行了大量廣泛而深入的研宄，在紅曲色素分離、結構鑒定、菌種改良、液態發酵工藝優化、代謝產物基因調控、功能性及安全性等理論和應用方面的研宄都卓有成效，不斷拓展著紅曲色素的應用領域。近年來，隨著對紅曲中生物活性物質研宄不斷發展，各國學者對其進行深入而廣泛研宄，發現紅曲能產生許多令人矚目次級代謝產物，如紅曲色素、膽固醇抑制劑、及具有降血壓、抗菌、降血氨、抗腫瘤、降血糖等生理活性成分，使傳統紅曲增添新的內涵。一種天然物質能同時具有多項生物活性實屬罕見，因此開發紅曲新功能現已成為各國研宄熱點之一。
[0003]紅曲菌兩種代謝產物Monascopyridine A(MCA)和 Monascopyridine B(MCB)是由德國科學家 Wild 等(Wild D, et al.New Monascus metabolites with a pyridinestructure in red fermented rice.J Agric Food Chem, 2003, 51, 5493 - 5496)首次在紅曲米或以紅曲米粉為發酵培養基進行液態發酵得到的，并對其結構進行了表征，然而，對MCA和MCB的分離方法和生物活性未做具體研宄。目前，我們發現橙色紅曲菌AS3.4384在敲除 pksCT 基因后得到的 PHDS26 菌株(Fu G, Xu Y, et al.Construct1n of a replacementvector to disrupt pksCT gene for the mycotoxin citrinin b1synthesis inMonascus aurantiacus and maintain food red pigment product1n.Asia Pac J ClinNutr, 2007, 16 (SI)，137-142 ;付桂明；橙色紅曲菌pksCT gene的敲除和長同源臂置換型打靶載體的構建[D];南昌大學；2007年)，MCA和MCB的產量大大提高，且原始菌株AS3.4384幾乎不產MCA和MCB。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供紅曲菌代謝產物MCA和MCB的制備方法。本發明提供橙色紅曲菌AS3.4384幾乎不產MCA和MCB，然而在敲除pksCT基因后，MCA和MCB的產量大大提高，分別達到2.07和1.96g/kgo
[0005]本發明所述的紅曲菌代謝產物MCA和MCB的制備方法，包括如下步驟:
[0006](I)紅曲菌孢子懸液的制備。
[0007]將橙色紅曲菌株AS3.4384和其pksCT基因缺失株PHDS26分別接種到MPPY液體培養基中(4%葡萄糖，0.2%酵母浸膏，0.3% NaNO3,0.05% KC1，pH 6.8)，恒溫搖床培養2?4d，120?250r/min，28?35°C ;用移液槍吸取ImL培養液接種在MES固體培養基上28?30°C培養10?12d ;長出大量孢子后，用孢子洗液洗脫孢子；500目的雙層尼龍布過濾后得到均一的孢子懸液。
[0008](2)菌絲和發酵液的收集。
[0009]對菌株AS3.4384和PHDS26的孢子懸液進行適當的稀釋后分別接種到50mL YES液體培養基(I?10%酵母浸膏，2?30%蔗糖)，搖勻，培養基中的孢子終濃度為(I?10) X 13個/mL，30°C靜置培養16?26d。發酵結束后，取出三角瓶，用濾紙將菌體和發酵液過濾，收集發酵液，將濕菌體在60°C下烘干后研碎，收集干燥的菌體，研磨成粉后備用。
[0010](3) MCA和MCB的提取與初分離。
[0011]菌絲體粉末用超聲波輔助提取，提取條件:60?100%甲醇、30?60°C、10?30min、固液比1:25 (w/v, kg/L)，兩者提取液皆8000r/min離心20min，收集提取液，提取液在60°C下旋轉蒸發，濃縮至干，殘渣用乙酸乙酯復溶得到初提液，作硅膠柱分離用。采用硅膠柱層析法對樣品進行初步分離，稱取一定量的200-300目的硅膠，加入正己烷:乙酸乙酯(7:3，v/v，L/L)用玻璃棒充分攪拌，裝柱；沉降完成后，將一定量的初提液上樣，用正己烷:乙酸乙酯(7:3，v/v, L/L)洗滌，收集洗脫液，60°C濃縮至干，加入乙醇復溶，用本發明的技術效果中的HPLC方法檢測，以確定含有目標產物的溶液，待收集到一定量后，旋轉濃縮至干，用無水乙醇復溶，0.22 μ m微孔濾膜過濾，備用。
[0012](4) MCA 和 MCB 的純化。
[0013]采用半制備高效液相色譜法對MCA和MCB進行純化，半制備型HPLC條件為:色譜柱:Zorbax SB-C18 (9.4X 150mm, 5 μ m);流動相:乙腈 / 水(75:25, v/v,mL/mL);檢測波長:300nm ;溫度:室溫(25°C );樣量:200 μ I。分別收集兩種目標產物洗脫液，并將兩者的洗脫溶液于60°C下旋轉蒸發濃縮至干，得到純度大于95%的MCA和MCB。
[0014]本發明MCA和MCB的生物活性測定。
[0015]采用MTT法檢測了 MCA和MCB對H印G2細胞增殖抑制的影響，結果顯示，MCA和MCB能明顯抑制H印G2細胞的增殖，MCA和MCB對H印G2細胞抑制的IC5tl值分別為40.0和20.0 μ g/mL0
[0016]發酵液用同體積的甲醇萃取，菌絲用超聲波輔助提提取，提取條件:60?100%甲醇、30?60。。、10?30min、固液比1:25，兩者提取液皆8000r/min離心20min，0.22 μπι微孔濾膜過濾后用HPLC檢測兩種代謝產物。
[0017]HPLC測定條件經過優化如下:
[0018]色譜柱:Hypersil0DS-2 (5 μ m，250 X 4.6mm，Thermo 公司)；流動相:乙腈-水(60:40，v/v);檢測波長:300nm ;柱溫:25°C ;流速:0.8mL/min ;進樣量:20yLo
[0019]本發明的技術效果:目前文獻報道(Wild D, et al.New Monascusmetabolites with a pyridine structure in red fermented rice.J Agric FoodChem, 2003, 51，5493 - 5496.)中采用大米或大米粉發酵得到該紅曲菌代謝產物，通過本發明的方法采用紅曲菌PHDS26液態發酵獲得的菌絲體，使得MCA和MCB的產量分別達到2.07和1.96g/kg。本發明采用超聲波輔助提取，優化后的提取條件:90%甲醇、40°C、20min、固液比1:25 (w/v, kg/L)，比上述文獻報道的提取方法(采用乙腈作為提取劑)提取率提高了約50%。另外，本發明采用的HPLC分析方法不需要進行梯度洗脫，樣品提取過程中不需要添加0.25M的磷酸，操作較上述文獻簡便，且MCA和MCB的保留時間較文獻中保留時間短。
【具體實施方式】
[0020]本發明將通過以下實施例作進一步說明。
[0021]實施例1。橙色紅曲菌AS3.4384及其pksCT基因缺失株PHDS26MCA和MCB產量的比較。
[0022]1.1按照上述紅曲菌代謝產物MCA和MCB的制備方法分別制備橙色紅曲菌AS3.4384及其pksCT基因缺失株PHDS26的菌絲體，然后采用HPLC方法對不同菌絲樣品中MCA和MCB含量進行測定。
[0023]1.2色譜條件。
[0024]采用色譜柱Hypersil ODS-2 (5 μ m，250 X 4.6mm)為檢測用色譜柱，乙腈-水(60:40，v/v)為流動相，柱溫為25°C，流速為0.8mL/min，檢測波長為300nm。
[0025]1.3結果分析。
[0026]對于橙色紅曲菌AS3.4384，菌絲和發酵液中均未檢測出MCA和MCB ;在基因缺失株PHDS26的發酵液中也未檢測到MCA和MCB，但在其菌絲中卻檢出較多的MCA和MCB，結果顯示，在發酵到16天時，基因缺失株PHDS26的菌絲粉中MCA和MCB的產量達到最大值，分別為 2.07g/kg 和 1.96g/kg，
[0027]實施例2。MCA和MCB超聲波輔助提取條件的優化。
[0028]1.1對影響超聲波提取效果的溶劑濃度、超聲波頻率、提取時間