羊口瘡病毒毒力基因vir 缺失突變株及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程用于獸醫生物技術領域，具體涉及一種羊口瘡病毒弱毒疫苗 及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 羊口瘡亦稱羊傳染性膿皰（Contagious Ecthyma，CE)、接觸傳染性膿皰皮炎 (Contagious pustular dermatitis，CPD)、羊傳染性胺瘡（Ecthyma Contagiosum)等，是由 羊口瘡病毒（〇rf virus，0RFV)所引起的一種綿羊和山羊的接觸性傳染病，在臨床上以口 唇、舌、鼻、乳房等皮膚和黏膜形成紅斑、丘瘆、結節、水皰、膿皰、潰瘍和疣狀厚痂為特征。該 病通過直接接觸傳染，以3~6月齡的羔羊最易感，常呈群發性流行；鹿、駱駝、麝牛、人也可 感染。該病在在養羊集中的國家和地區廣泛流行，給養羊業造成了較嚴重的經濟損失。
[0003] 疫苗接種是防控該病的主要手段，常規的ORF滅活苗和弱毒苗在預防該病的發生 和流行過程中起到一定作用，它能在一定程度上降低疾病的感染率，但現有的常規疫苗也 存在一定的缺陷。ORF滅活苗是用物理的或化學的方法將ORFV滅活，使其喪失感染性和繁 殖能力，這種疫苗雖然安全性高、穩定性強，但由于在滅活過程中病毒的抗原性發生的一定 的改變，免疫期較短，免疫效果不夠理想，且主要誘導機體的體液免疫應答，不能誘導特異 性的細胞免疫。
[0004] 弱毒疫苗是將ORFV強毒株通過細胞連續傳代進行人工馴化獲得減毒毒株， 其優點是免疫原性強，可誘導機體產生堅強的體液和細胞免疫，免疫力較為持久。如 CN201110452835. 7公開了一種山羊口瘡病毒毒力弱化方法，利用犢牛睪丸細胞系，通過羊 口瘡病毒的連續傳代培養，致使羊口瘡病毒毒力致弱，為羊口瘡病毒弱毒疫苗制備生產提 供了穩定可靠的方法，用以獲得大量的穩定的疫苗。但其缺點是研發周期長，馴化難度高， 很難在短時間得到免疫原性理想的減毒毒株。近年來，隨著ORFV病毒變異株的出現，現有 ORF疫苗使其不能提供完全保護，從而導致羊傳染性膿皰病的頻繁暴發。因此有必要借助具 有突出優勢的技術手段研宄快速降低ORFV毒力的方法，為ORF疫苗的研發提供技術支撐。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是針對現有人工馴化羊口瘡病毒弱毒株周期長、免疫原性易發生 改變等缺點，采用基因工程方法通過對羊口瘡病毒毒力基因 VIRQnterferon resistance gene，干擾素抗性因子）進行缺失以實現其毒力快速降低，提供一種制備毒力顯著降低但 仍保持良好的免疫原性的弱毒疫苗制備方法。
[0006] 本發明的目的是通過如下技術方案來實施的：
[0007] -種羊口瘡病毒毒力基因 VIR缺失突變株的制備方法，具體步驟如下：
[0008] A、采用PCR方法克隆包含0RFV-SHZ1株VIR毒力基因及側翼序列的基因片段，用 酶切方法缺失掉VIR毒力基因，在缺失位點插入帶有痘苗病毒晚期啟動子Pll和LacZ報告 基因的表達盒，構建以LacZ基因為篩選標記的重組穿梭載體；
[0009] B、將重組穿梭載體轉染到ORFV感染的Vero細胞中進行同源重組，經蝕斑篩選純 化獲得VIR毒力基因缺失的重組病毒ORFV- Δ VIR-LacZ。
[0010] 所述0RFV-SHZ1株VIR毒力基因的序列如SED ID NO. 1所示。
[0011] 步驟A所述的包含0RFV-SHZ1株VIR毒力基因及側翼序列的基因片段，制取時優 選方法用病毒提取試劑盒提取0RFV-SHZ1株基因組DNA，用P1-P2引物擴增出含VIR毒力基 因及上下臂的序列，回收PCR擴增產物，將其與pMD18-T-simple載體連接，獲得pVIR重組 質粒，其中：
[0012] Pl 的序列為：5' -ATCGTGAACACCAAGACCT-3'，
[0013] P2 的序列為：5' -TTGTGCACGCTGCGCGC-3'。
[0014] 所述引物Pl序列如SED ID NO. 2所示、引物P2序列如SED ID NO. 2所示。
[0015] 所述VIR基因上下同源臂的基因序列如SED ID NO. 4所示。
[0016] 所述步驟A中酶切方法缺失掉VIR毒力基因的優選操作為：用Sph I和 BglII (629-827bp)雙酶切pVIR重組質粒，對VIR基因進行缺失突變。
[0017] 所述步驟A中帶有痘苗病毒晚期啟動子Pll和LacZ報告基因的表達盒采用限制 性內切酶XbaI從pSC-ΙΙ穿梭載體上切下含有痘苗病毒晚期啟動子Pll和報告基因 IacZ 的基因片段。
[0018] 步驟B中的蝕斑篩選純化采用DMEM原液對同源重組毒稀釋，接種Vero細胞，逐 日觀察轉染細胞，待出現細胞病變（CPE)和藍斑后，優選待發現明顯的細胞病變和藍斑后， 無菌挖取藍斑，反復凍融，重新接種Vero細胞，待出現細胞病變（CPE)和藍斑后，連續接種 Vero細胞，得到純化的重組病毒ORFV- Δ VIR-LacZ。
[0019] 反復凍融一般進行2~6次為宜。
[0020] 一種羊口瘡病毒毒力基因 VIR缺失突變株，其TCID5tl為IX 10 _3 5/mL。
[0021] 本發明采用基因工程方法通過對羊傳染性膿皰病毒VIR毒力基因進行缺失以實 現其毒力快速降低，為制備毒力顯著降低但仍保持良好的免疫原性的弱毒疫苗提供一種快 速可靠的制備方法。而且生產周期短、不需要馴化即可得到免疫原性理想的減毒毒株。即 使ORFV病毒變異，也可以迅速弱化毒力，治愈羊傳染性膿皰病。
【附圖說明】
[0022] 圖1為重組ORFV- Δ VIR-LacZ產生的藍蝕斑無菌挖出純化結果圖；
[0023] 圖2為重組病毒毒在Vero細胞上產生的CPE及藍蝕斑；
[0024] 圖 3 為 ORFV-Δ VIR-LacZ 和 0RFV-SHZ1 株的生長曲線。
【具體實施方式】
[0025] 本發明提供一種制備羊口瘡病毒VIR毒力基因缺失株的構建方法，用于制備毒力 顯著降低但仍保持良好免疫原性的弱毒疫苗候選株，包括以下幾個方面內容：
[0026] UORFV的細胞培養
[0027] 用Vero細胞培養ORFV SHZl流行株，生長液用含8%犢牛血清的DMEM液，維持液 用含2%犢牛血清的DMEM液。在細胞生長成單層時接毒，待80%細胞出現典型的CPE時收 毒。反復凍融三次，5000rpm離心10min，取上清作為提取總DNA的材料。
[0028] 2、ORFV基因組DNA的提取
[0029] 分別取200 μ L ORFV SHZl株病毒液，加入I. 5mL離心管中；然后向離心管中加入 200 μ L的Solution A，劇烈震蕩混勻后，室溫放置5min ;再加入75 μ L的Solution B，混合 均勾后，12000rpm離心5min ;將上清液轉移到新的Collection Tube (2mL，試劑盒中提供） 中，加250 yL異丙醇（1 %冰乙酸），上下顛倒混勻；將試劑盒中的Spin Column安置于另 一新的Collection Tube(2mL，試劑盒中提供）上，將上述上清液轉移至Spin Column中， 12000rpm離心lmin，棄濾液；將500 μ L的Rinse A加入至Spin Column中，室溫靜置lmin， 12000rpm 離心 lmin，棄濾液；將 800 μ L 的 Rinse B 加入至 Spin Column 中，12000rpm 離心 lmin，棄濾液；再次進行12000rpm離心Imin ;將Spin Column安置于新的I. 5mL的離心管 上，在Spin Column膜中央處加入50 μ L的滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置Imin; 12000rpm離心Imin洗脫病毒DNA，收集到的DNA用于下一步操作或-20°C保存。
[0030] 3、VIR毒力基因和上下臂的PCR擴增與克隆
[0031] 根據GenBank中公布的0RFVSA00株基因組序列（AY386264)，引物 Pl (5' -ATCGTGAACACCAAGACCT-3'）和引物 P2 (5' -TTGTGCACGCTGCGCGC-3'），用擴增出含 VIR毒力基因及上下臂的PCR擴增產物，由北京華大基因公司合成。將合成的引物進行低溫 瞬時離心，加入滅菌雙蒸水配成100pmol/uL 〇
[0032] 用病毒提取試劑盒提取0RFV-SHZ1株基因組DNA，以此為模板進行PCR擴 增反應。PCR反應條件如下：反應體系為：10Xbuffer(含MgC12)2.0yL，2.5mmol/L (1階1 30.6 41^，20_〇1/1上下游引物各0.5 41^，0嫩模板141^，了390嫩(2.5"1^)聚合酶 0. 5yL，用滅菌蒸餾水補足體積至20yL。反應條件為：95°C預變性5min，94°C變性50s， 61°C/62°C /60°C /59°C /54°C 退火 40s，72°C 延伸 120s，共 35 個循環，最后 72°C 延伸 10min。 獲得片段大小為1550bp的擴增產物，與預期的DNA片段長度相符。回收PCR擴增產物，將 其克隆入pMD18-T-simple載體得到pVIR重組質粒。將pVIR測序，證實已經成功克隆得到 VIR毒力基因和上下臂片段。
[0033] 4、穿梭載體p Δ VIR-LacZ的構建和鑒定
[0034] 4. IplI-LacZ基因片段的獲得
[0035] 用限制性內切酶XbaI從pSCll穿梭載體上切下含有痘苗病毒晚期啟動子Pll和 報告基因 IacZ的基因片段，進行凝膠電泳回收目的片段（3845bp)，并對兩端黏性末端進行 補平。
[0036] 4. 2穿梭載體p Δ VIR-LacZ的構建
[0037] 用Sph I和BglII (629-827bp)雙酶切pVIR重組質粒，對VIR基因進行缺失突變， 回收大片段，并進行兩端黏性末端補平。將含有Pll啟動子和LacZ的基因片段與pVIR大 片段連接，獲得重組穿梭載體P Δ VIR-LacZ。通過PCR和測序p Δ VIR-LacZ進行驗證。
[0038] 4. 3穿梭載體p Δ VIR-LacZ的分子鑒定
[0039] 構建好的穿梭載體p Λ VIR-LacZ單酶切可得到7835bp的片段，與預期大小完成相 符。用LacZ引物可以擴增出2400bp的產物，表明穿梭載體p AVIR-LacZ構建正確。
[0040] 5、穿梭載體p AVIR-LacZ轉染
[0041] 5. IVero單層細胞培養
[0042] Vero細胞傳到六孔板中，每孔2mL，待細胞70% -80 %鋪于板底時備用。
[0043] 5. 2Vero細胞接種痘苗病毒
[0044] 按ORFV病毒液：細胞培養液=1:10體積比將ORFV接種6孔板Vero細胞，每孔 200 μ L。37°C吸附2h，然后吸棄病毒液，加入含2%犢牛血清DMEM培養液，37°C，5% 0)2培 養箱培養4-6h。再用Invitrogen公司的脂質體轉染Vero細胞。
[0045] 5. 3脂質體介導重組質粒轉染Vero細胞
[0046] 制備A液和B液。A液是DMEM原液加4 μ L脂質體，B液是DMEM原液加1. 6 μ g重 組質粒。A液、B液各制備130 μ L，室溫放置5min鐘后，將A液逐滴加入B液，輕輕混合均 勻，制成轉染液，共260 μ L，室溫放置30min以上。轉染液逐滴接種細胞，每孔接250 μ L，共 接5孔，第六孔做陰性對照。然后在37°C，5% CO2培養箱中培養4-6h，之后吸棄上清，加入 含2%犢牛血清DMEM培養液，在37°C，5% CO2培養箱中培養，逐日觀察轉染細胞，待出現細 胞病變（CPE)和籃板后，反復凍融3次，收取培養物，離心去掉細胞碎片，保存上清作為重組 痘苗