克魯斯假絲酵母lsa及其在降解氨氮中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一株克魯斯假絲酵母，以及該克魯斯假絲 酵母在降解氨氮中的應用。
【背景技術】
[0002] 畜禽養殖過程中產生的廢水和糞便在儲存過程中會產生大量的惡臭氣體，其中以 氨氣的危害最為明顯，輕者誘導家禽、豬等動物呼吸道疾病的發生，引起動物應激反應，重 者可引起中毒死亡。同時大量的氨氣排放促進可入肺顆粒物（PM2. 5)的形成，并擴散到大 氣中與一些酸性物質反應，形成銨鹽氣溶膠，導致生態系統富營養化和酸化。此外，含有高 濃度氨氮的畜禽養殖廢水如果處理不當，也會引起水體的富營養化。因此，治理養殖業生產 過程中氨氣和氨氮的排放對保護人類生態環境、改善動物健康和福利具有重要意義。
[0003] 研宄表明，畜禽養殖廢水和糞便中氨氮和氨氣的產生很大程度上依賴于其中微生 物的代謝活動，使通過調控環境微生物群落的活動控制氨氮或氨氣的生成成為可能。而現 有的控制養殖場氨氣污染的措施大都采用物理方法（如加強舍內通風、建造糞尿分離設施 等），運行成本高且因為沒有根本消除氨氮和氨氣對周邊環境的排放，仍會造成二次污染， 而采用微生物方法則能克服上述方法的缺陷，因此在治理畜牧養殖氨氣和氨氮污染方面具 有較高的應用價值。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供克魯斯假絲酵母LSA及其在降解氨氮中的應用。
[0005] 本發明提供的克魯斯假絲酵母（Candida krusei) LSA，已于2015年02月11日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所），保藏登記號為CGMCC NO. 10562。克魯斯 假絲酵母（Candida krusei) LSA CGMCC NO. 10562,簡稱克魯斯假絲酵母LSA。
[0006] 本發明還保護克魯斯假絲酵母LSA的培養物。
[0007] 本發明還保護克魯斯假絲酵母LSA的菌懸液。所述菌懸液具體可通過用無菌生理 鹽水重懸菌體得到。所述菌懸液中的菌濃度具體可為8. OX 108cfu/mL-9. OX 108cfu/mL。
[0008] 本發明還保護克魯斯假絲酵母LSA、所述培養物或所述菌懸液在制備產品中的應 用；所述產品的功能為如下（a)或（b)或（c)或（d) : (a)降解氨氮；(b)降解水中的氨氮； (c)降解糞便中的氨氮；（d)降低糞便的氨氣散發量。所述糞便可為畜禽糞便，例如雞糞。
[0009] 本發明還保護一種產品，其活性成分為克魯斯假絲酵母LSA、所述培養物或所述菌 懸液；所述產品的功能為如下（a)或（b)或（c)或（d) : (a)降解氨氮；(b)降解水中的氨氮； (c)降解糞便中的氨氮；（d)降低糞便的氨氣散發量。所述糞便可為畜禽糞便，例如雞糞。 [0010] 本發明還保護克魯斯假絲酵母LSA、所述培養物或所述菌懸液在降解氨氮中的應 用。所述降解氨氮具體可為降解水中的氨氮或降解糞便中的氨氮。所述糞便可為畜禽糞便， 例如雞糞。所述應用中，溫度可為20-40 °C，具體可為30 °C。所述應用中，pH值可為3. 0-7. 0， 具體可為7.0。所述應用中，具體可以采用葡萄糖作為克魯斯假絲酵母LSA生長所需的碳 源。所述應用中，克魯斯假絲酵母LSA生長所需碳氮質量比可為10-40,具體可為20。
[0011] 本發明還保護克魯斯假絲酵母LSA、所述培養物或所述菌懸液在降低糞便的氨氣 散發量中的應用。所述糞便可為畜禽糞便，例如雞糞。
[0012] 本發明還保護一種降解氨氮的方法，包括如下步驟：將克魯斯假絲酵母LSA、所述 培養物或所述菌懸液與含有氨氮的樣本混合，實現降解氨氮。
[0013] 本發明還保護一種降低糞便的氨氣散發量的方法，包括如下步驟：將克魯斯假絲 酵母LSA、所述培養物或所述菌懸液施加于糞便，從而降低糞便的氨氣散發量。所述糞便可 為畜禽糞便，例如雞糞。
[0014] 本發明還保護一種降低畜禽舍內的氨氣濃度的方法，包括如下步驟：將克魯斯假 絲酵母LSA、所述培養物或所述菌懸液施加于畜禽舍內，從而降低畜禽舍內的氨氣濃度。
[0015] 本發明提供的克魯斯假絲酵母，培養方法簡單、生長速度快、能耐受高濃度的氨 氮、環境適應性強、安全性高。本發明提供的克魯斯假絲酵母可應用于如下方面：（1)由于 其具有很強的氨氮降解能力，可用于改善氨氮污染的水質問題，適用于含高濃度氨氮的廢 水治理；（2)由于其可降低糞便氨氣的散發量，可用于畜禽舍內，改善舍內環境衛生；（3)其 生長條件接近雞胃腸道的微環境，因此可作為雞的飼料添加劑使用，可以提高飼料中氮素 的利用率，在動物糞便中存活的菌體又能進一步減少氨氣的散發量，從而達到改善舍內環 境的作用。本發明具有較好的應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為克魯斯假絲酵母LSA的菌落圖片。
[0017] 圖2為克魯斯假絲酵母LSA的電鏡圖片。
[0018] 圖3為克魯斯假絲酵母LSA降解高濃度氨氮的曲線圖。
[0019] 圖4為溫度㈧和pH⑶對克魯斯假絲酵母LSA生長的影響。
[0020] 圖5不同碳源㈧和C/N(B)對克魯斯假絲酵母LSA氨氮去除率的影響。
[0021] 圖6為克魯斯假絲酵母LSA對家禽糞便氨氣產生的控制效果圖。
【具體實施方式】
[0022] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。以下實施例中，用于制備各個培養基的水均為去離子水。以下實施例中用OD 6cicilJt 表征菌體生長量。C/N即碳氮質量比，又稱碳氮比。
[0023] Yro液體培養基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，水lOOOmL，自然pH。
[0024] 基礎培養基：碳源、（NH4) 2S04、NaCl L 0g、K2HPO4 · 2Η200· 5g，MgSO4 · 7Η200· 25g，微 量元素溶液 I. 〇ml，水 1000mL，調 ρΗ7· 2-7. 4。（NH4)2SO4S氮源。
[0025] 微量元素溶液：EDTA 10. 0g、ZnSO4L 2g、CaCl2L 5g、MnCl2 · 4H20 I. 0g、 FeSO4 · Η202· 0g、（NH4)6Mo7O24 · 4H20 I. 0g、CuSO4 · 5H20 lg、CoCl2 · 6H20 I. 0g，水 1000mL，調 pH 7. 2-7. 4〇
[0026] 氨氮（NH4+-N)含量的測定方法采用水楊酸-次氯酸鹽光度法（GB7481 -1987)。
[0027] 實施例1、克魯斯假絲酵母LSA的分離純化及鑒定
[0028] 一、克魯斯假絲酵母LSA的分離純化
[0029] 1、氨氮降解菌的富集
[0030] 取20g雞糞樣品，接種于裝有100mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中（瓶中加入滅菌玻璃 珠），30°C、150r/min振蕩30min使菌膠團充分打散，靜置20min。取上清液5ml，接種于裝 有100mL富集培養基的錐形瓶中，30°C、150r/min振蕩培養2天，取Iml培養液再次接種于 新的富集培養基中，如此反復連續富集10代。
[0031] 2、氨氮降解菌的篩選、分離和純化
[0032] 吸取富集培養液1ml，經KT1梯度稀釋后，取200 μ 1涂布于分離平板上，30°C培養 24~72h。24h后開始觀察菌的生長情況，選取生長快、菌落大、數量多的菌落采用三線法進 行純化。純化3代后，分別進行4°C斜面保存。
[0033] 將分離純化后的供試菌株接種于活化培養基中，30°C振蕩培養18_24h。然后按 10%的接種量接種于無菌離心管中，4000r/min離心10min，棄上清液，用0. 86%無菌生 理鹽水洗滌三次，最后用同體積的無菌生理鹽水制成菌懸液，接種于50ml篩選培養基中， 30°C、150r/min振蕩培養24h，測定氨氮含量，篩選出一株降解效果最好的菌株，命名為 LSA0
[0034] 二、菌種的鑒定
[0035] 1、形態觀察
[0036] 將LSA菌株接種在YPD固體培養基平板上，觀察菌落形態特征。LSA菌株的菌落 照片見圖1，電鏡照片見圖2。LSA菌株呈點狀，白色、不透明，邊緣光滑，凸起，無光澤，菌株 為卵圓形、易堆積。
[0037] 2、生化鑒定
[0038] 采用生物梅里埃（biomerieux)Vitek32-YST鑒定卡片對LSA菌株進行生理生化鑒 定，鑒定結果為Candida krusei。
[0039] 3、分子生物學鑒定
[0040] 對LSA菌株的18S rDNA進行擴增，將純化后的PCR產物測序，測序結果如序列表 的序列1所示。
[0041] 綜合形態鑒定、生化鑒定和分子生物學鑒定的結果，LSA菌株屬于克魯斯假絲酵母 (Candida krusei)〇
[0042] 克魯斯假絲酵母（Candida krusei)LSA，已于2015年2月11日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1 號院3號，中國科學院微生物研宄所），保藏登記號為CGMCC NO. 10562。克魯斯假絲酵母 (Candida krusei) LSA CGMCC NO. 10562,簡稱克魯斯假絲酵母 LSA。
[0043] 實施例2、克魯斯假絲酵母LSA降解氨氮功能的研宄
[0044] 一、克魯斯假絲酵母LSA對高濃度氨氮的降解特性研宄
[0045] 1、制備培養基甲
[0046] 培養基甲：采用葡萄糖作為唯一碳源，在基礎培養基的基礎上調整碳源和 (NH4) 2SO4的濃度，使氨氮濃度為1200mg/L，C/N為10, pH為7. 0。
[0047] 2、挑取克魯斯假絲酵母LSA單克隆，接種于IOOmL ΥΗ)液體培養基中，30°