一種具有核殼結構的胍基固定化親和磁球的制備及應用
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明涉及磁性納米材料領域，低豐度特殊結構蛋白質或多肽的分離分析檢測領域，具體地是一種利用蒸餾沉淀聚合法制備一種以超順磁性四氧化三鐵微球為內核，聚合物層為外殼包裹的核-殼結構材料，利用其固定胍基實現對特殊結構蛋白質或者多肽的特異性富集檢測方法。
【【背景技術】】
[0002]蛋白質可逆磷酸化修飾是一種重要的翻譯后修飾方式之一，盡管磷酸化蛋白質組學取得了很大進步，但仍然存在一些問題，如磷酸肽離子化效率低，低豐度磷酸肽信號常被同時存在的高豐度非磷酸肽信號所抑制和干擾。為了解決這些問題，在質譜分析前，需要選擇性將磷酸肽從樣品中分離出來。
[0003]固定金屬離子親和色譜法和金屬氧化物親和色譜法是兩種常用的分離富集方法。其中，固定金屬離子親和色譜法在分離富集時偏向富集多磷酸肽，而金屬氧化物親和色譜法則偏向富集單磷酸肽和酸性多肽，單獨使用這兩種方法均無法全面而深度獲得磷酸化蛋白質組學信息。因此，發展精細富集單磷酸肽或多磷酸肽的富集方法是提高其分析能力的有效途徑。
[0004]磁性納米顆粒具有優良的生物兼容性、制備簡便、表面易于修飾和獨特的超順磁性等特征，被廣泛應用于蛋白質和多肽的特異性分離和富集，如去除高豐度蛋白質、萃取低豐度蛋白質和多肽、特異性分離富集糖肽和磷酸肽，吸附組氨酸標記蛋白質和多肽等。核-殼結構聚合物包覆磁性納米顆粒具有濃密聚合物層、高密度鍵合基團和良好的磁響應性能等特征，被廣泛應用于蛋白質和多肽樣品前處理流程。汪等制備出雙聚合物層包覆磁球，在磷酸基上螯合鈦離子得到磁性固定金屬離子親和色譜吸附劑，用于選擇性富集磷酸肽。隨后，在甲基丙烯酸聚合物層包覆磁球表面鍵合苯硼酸，用于在生理條件下高容量富集分離糖蛋白。鄒等采用原子自由基聚合反應制備支鏈狀聚乙二醇刷子修飾磁球，在刷子末端固定磷酸酯鈦，制備的刷子狀親和色譜吸附劑表面鈦離子鍵合量得到增加，提高對磷酸肽富集容量。
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【發明內容】
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[0005]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種具有核殼結構的胍基固定化親和磁球的制備及應用。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0007]一種具有核殼結構的胍基固定化親和磁球的制備方法，其具體步驟為:
[0008]第一、乙烯基修飾的磁球的制備
[0009]將250mg?350mg直徑為50nm?500nm超順磁性四氧化三鐵微球均勾分散在比例為4: I?6: I之間的水和乙醇的混合溶劑中，加入ImL?2mL濃氨水，逐滴加入0.6mL?1.0mL的3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸酯，溫度穩定在50°C?70°C之間，機械攪拌I天?1.5天，得到乙稀基修飾的磁球。
[0010]第二、核-殼結構的聚合物包覆磁球的制備
[0011]稱取40mg?80mg的步驟一中制備的乙稀基修飾的磁球均勾分散在30mL?50mL的乙腈溶液，加入100 yL?180 μ L的甲基丙烯酸縮水甘油酯和120mg?180mg N，N-亞甲基雙丙稀酰胺及3mg?7mg偶氮二異丁腈，溫度穩定在95°C?105°C之間，維持Ih?2h，得到以四氧化三鐵微球為內核，聚合物層為外殼，具有核-殼結構的聚合物包覆磁球；
[0012]第三、氨基鍵合的聚合物包覆磁球的制備
[0013]將步驟二中制備的核-殼結構的聚合物包覆磁球分散在60mL?10mL的無水乙二胺溶液中，溫度穩定在70°C?90°C之間，維持2h?4h，得到氨基鍵合的聚合物包覆磁球；
[0014]第四、將步驟三中制備的氨基鍵合的聚合物包覆磁球加入體積為20mL?40mL含有5mmol/L?15mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，用lmol/L氫氧化鈉或lmol/L鹽酸將溶液pH值調整為6.5?8.5，加入80mg?120mg S-乙基異硫脲氫溴酸鹽，通入氮氣保護，穩定穩定在65V?75°C之間，維持2h?4h，得到具有核殼結構的胍基固定化的聚合物包覆磁球。
[0015]一種具有核殼結構的胍基固定化親和磁球的應用方法，其具體步驟為:
[0016]第一、將胍基固定化的聚合物包覆磁球用水溶液和乙腈溶液依次清洗3?5次，除去表面未反應的試劑；
[0017]第二、將步驟一中得到的磁球置于上樣液I (45%?55%乙腈-水，0.05mmol/L?
0.15mmol/L醋酸)或上樣液2 (64%?68 %乙腈-水，0.01 %?0.03 %三氟乙酸)，與5mg/L?20mg/L蛋白酶解溶液例如α-酪蛋白(a-casein)和酪蛋白(β-casein)酶解液進行混合1min?30min，利用外置磁鐵對磷酸根修飾的蛋白質或者多肽進行選擇性富集和快速分離，實現對低豐度結構特殊的蛋白質和多肽的特異性富集和分離；
[0018]第三，將吸附蛋白質或多肽的磁球用40 %?60 %乙腈-水，I %?3 %三氟乙酸溶液進行洗脫，利用基質輔助激光解析飛行時間質譜儀或者高效液相色譜-質譜聯用儀進行檢測，計算磁球對磷酸化蛋白質或多肽的富集選擇性，富集容量，富集回收率和檢測靈敏度。
[0019]與現有技術相比，本發明的積極效果是:
[0020]利用本發明制備的以超順磁性四氧化三鐵微球為內核，聚合物層為外殼，具有核-殼結構的復合材料可以分別實現對α -酪蛋白(a -casein)或β-酪蛋白(a -casein)酶解液中多磷酸肽或者全磷酸肽的選擇性富集，對磷酸肽富集容量達到200mg/g，對磷酸肽檢測限達到0.5fmol，對磷酸肽的富集回收率達到91.30%。利用材料的超順磁性，可在30s內實現快速完全的分離。
[0021]本方法制備的核殼結構磁球的聚合物層存在大量活性作用位點，可固定高容量的胍基配體，實現高度特異性與磷酸化修飾的蛋白質或多肽相結合，具有很高的富集容量、富集回收率和檢測靈敏度。此外，該材料具備超順磁性，能縮短樣品前處理時間，提高處理效率，進而提尚其分尚富集能力。
【【附圖說明】】
[0022]圖1是以超順磁性四氧化三鐵微球為內核，聚合物層為外殼，具備核-殼結構的復合材料形貌圖(a (TEM)和b (SEM))。
[0023]圖2是以超順磁性四氧化三鐵微球為內核，聚合物層為外殼，具備核-殼結構的磁球，胍基進行功能化修飾的復合材料的傅里葉紅外表征圖。(a，磁球；b，核-殼結構的聚合物包覆磁球；C，胍基固定化的聚合物包覆磁球。)
[0024]圖3是具有核殼結構的胍基固定化聚合物包覆磁球用于選擇性分離富集β-酪蛋白(β-c