一種新型融合蛋白nscr5及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物高分子研宄領域，主要是涉及一種新型融合蛋白NSCR5及其制備方法。
【背景技術】
[0002]多肽類(或蛋白類)是性能優越的新型載體材料，在藥物靶向運輸，尤其是抗腫瘤藥物的靶向運輸和定點釋放方面取得良好的研宄結果。由于多肽分子鏈較短，單分子藥物負載能力較弱，已有多肽載藥均通過多肽的多級組裝形成較大的藥物負載復合物來實現。長肽或蛋白質較多肽具有更長的分子鏈，單分子藥物負載能力高于多肽，且具有更加豐富多變的組裝形式，其材料學性能更為優越。但長肽和蛋白質無法通過化學方法獲得，因此在獲取方法限制的情況下，長肽和蛋白質相關生物醫學應用研宄報道較少。
【發明內容】
[0003]本發明新型融合蛋白NSCR5由蜘蛛絲蛋白氮端序列(NT)、果蠅彈性蛋白(Resilin)、蜘蛛絲蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉積肽(R5)等4個主要功能肽段構成，各單一肽段的功能均已為研宄所證實，但將蜘蛛絲蛋白氮端序列(NT)、果蠅彈性蛋白(Resilin)、蜘蛛絲蛋白碳端序列(CT)和硅藻硅沉積肽(R5)等4個肽段順次連接融合形成4嵌段線型蛋白的研宄尚未見報道，相關制備方法亦未見報道。本發明融合蛋白NSCR5為人為將4個天然肽段融合形成的非天然4嵌段線型蛋白質。該人工4嵌段線型蛋白質具有多種優良性能，包括優異的機械性能(高彈性)、自組裝形成規則宏觀結構的性能(自組裝性能)以及沉積Si02介導有機-無機材料復合的性能(硅沉積性能)。這些性能賦予該融合蛋白優良的藥物負載緩釋性能、易加工性以及優良的產品穩定性，在生物醫藥領域具有廣闊的應用前景。
[0004]本發明的目的是發明一種性能優異的生物醫用高分子，具體為新型融合蛋白NSCR5。本發明的主要發明創新內容為:
[0005](I)本發明融合蛋白NSCR5為人工設計制備的跨物種融合蛋白，不存在天然對應體或類似物。融合蛋白NSCR5的氨基酸序列(SEQ NO: 3)經NCBI數據庫BLASTp比對分析，表明NSCR5中存在3段分別與蜘蛛絲蛋白和果蠅彈性蛋白高度相似的區域，最高覆蓋率72%時，相似度為77% ;綜合最高相似度為:覆蓋率為56%時，相似度95%，未發現覆蓋率超過72%的高度相似蛋白。此外，由于蜘蛛和果蠅間存在自然條件下不可能逾越的生殖隔離，因此沒有理論依據支持可能存在天然的本發明所述融合蛋白NSCR5。
[0006](2)本發明制備融合蛋白NSCR5所用基因序列非天然基因序列，是經過密碼子改造并由人工合成的全新基因序列。由于編碼融合蛋白NSCR5的4個天然肽段的基因序列存在大量大腸桿菌稀有密碼子，且編碼的肽鏈具有較高的甘氨酸比例，不適合直接在大腸桿菌中表達。因此，本發明對編碼融合蛋白NSCR5的基因密碼子進行了優化，移除了所有稀有密碼子，并對甘氨酸密碼子進行了均衡分配，最后通過全基因合成法獲得新型人造融合蛋白NSCR5的基因(圖2，SEQ NO:2)。融合蛋白NSCR5基因序列經NCBI數據庫BLASTn比對分析，表明果蠅彈性蛋白肽段最高基因相似度為89%，覆蓋率為53%;蜘蛛絲蛋白肽段最高基因相似度為74%，覆蓋率為40 %，未發現覆蓋率超過53 %的高度相似基因。同樣由于生殖隔離的存在，沒有理論依據支持可能存在天然的本發明所述融合蛋白NSCR5基因。本發明共計對編碼NSCR5的1809個堿基中的307個造成低豐度密碼子的位點進行了改動，將編碼精氨酸的稀有密碼子全部改為非稀有密碼子，將編碼甘氨酸的高頻率重復密碼子替換為高豐度低重復度密碼子，將豐度較低的絲氨酸的密碼子做了均勻分布處理，改動前后全序列相似度為83.03% (改造前后序列差異和密碼子豐度差異見附圖4A和4B)。改動后的基因序列(圖2)直接插入質粒載體(圖6)并在大腸桿菌DH5 α細胞內合成NSCR5過程中，精氨酸、甘氨酸和絲氨酸轉運壓力大幅下降，轉運上述3中氨基酸能力大幅提高，NSCR5獲得高效合成。
[0007](3)本發明融合蛋白NSCR5同時具有pH響應自組裝性能、高彈性能和硅沉積強度增強性能。上述性能的集成，使得本發明融合蛋白NSCR5在醫用縫合、敷附、支架和載藥等方面具有巨大的應用潛力，且目前尚未見到同時具備上述性能的蛋白質材料。
[0008](4)在融合蛋白NSCR5基因上游設計了 Lac基因表達原件，使其能夠在大腸桿菌DH5a菌株中受IPTG誘導表達。并最終通過細胞破碎和鎳離子柱親和層析分離獲得本發明融合蛋白。其中，所述的大腸桿菌，購自寶生物工程(大連)有限公司，保藏號為GMl.571 ;質粒PUC57為公用質粒，由南京金斯瑞生物科技公司免費提供。
[0009]一方面，本發明提供一種一種新型融合蛋白NSCR5，其特征在于:該蛋白的序列為SEQ NO:3 所示。
[0010]優選的，其中，該蛋白由6聚組氨酸標簽前側序列、6聚組氨酸標簽(6X His)、蜘蛛絲蛋白氮端序列(NT)、果幡彈性蛋白(Resilin)、蜘蛛絲蛋白碳端序列(CT)和娃藻娃沉積肽(R5)等6段順次連接構成，長度為602個氨基酸殘基。
[0011]優選的，編碼融合蛋白NSCR5的基因序列為SEQ NO:2所示。
[0012]優選的，編碼融合蛋白NSCR5基因序列的上游還包括表達元件:Lac啟動子、Lac操縱子和Lac核糖體結合位點(RBS)(圖7)。
[0013]優選的，融合蛋白NSCR5的表達載體為TOC57，插入位點為EcoR V限制性酶切位點，表達宿主菌為大腸桿菌DH5 α菌株(圖5)。
[0014]優選的，融合蛋白NSCR5全基因長度為1809bp，其中6聚組氨酸標簽His)前側為包括起始密碼子在內的12bp，6聚組氨酸標簽His)密碼子長度為24bp，蜘蛛絲蛋白氮端序列(NT)密碼子長度為381bp，果蠅彈性蛋白(Resilin)密碼子長度為1014bp，蜘蛛絲蛋白碳端序列(CT)密碼子長度為372bp，硅藻硅沉積肽(R5)密碼子長度為57bp。
[0015]優選的，融合蛋白NSCR5基因上游序列長度為196bp，其中Lac啟動子34bp，Lac操縱子25bp，核糖體結合位點(RBS) 8bp?
[0016]優選的，位于PUC57上EcoR V位點的人工合成序列長度為2005bp。
[0017]另一方面，本發明涉及上述融合蛋白NSCR5的制備方法，包括以下步驟:
[0018]第一步，融合蛋白NSCR5表達載體構建JfSEQ NO:2所示的基因序列接插入到PUC57載體上EcoR V位點，獲得NSCR5表達載體；
[0019]第二步，將融合蛋白NSCR5表達載體導入大腸桿菌DH5a中，獲得NSCR5表達菌株;
[0020]第三步，融合蛋白NSCR5的自誘導表達:將NSCR5表達菌株接種到自誘導表達培養基中，于一定溫度下培養一定時間，獲得產物發酵液；
[0021]其中，自誘導表達培養基配方為:酵母抽提物1.0?5.0g/L，胰蛋白胨5.0?10.0g/L，酪蛋白胨5.0?15.0g/L，葡萄糖0.1?1.5g/L，磷酸氫二鉀4.0?10.0g/L，磷酸二氫鉀3.5?9.0g/L,磷酸銨2.0?6.0g/L,硫酸鎂0.2?1.6g/L，氯化鈣2.0?5.0mg/L，氯化鈷0.5?3.5mg/L，氯化銅0.5?1.5mg/L，硫酸錳1.2?5.0mg/L，鉬酸鈉3.2?8.0mg/L，硼酸 0.1 ?0.5mg/L，氯化鐵 1.0 ?8.0mg/L，氯化鋅 0.5 ?3.0mg/L，甘油 1.0 ?10.0g/L,絲氨酸0.5?2.0g/L,甘氨酸2.0?10.0g/L,酪氨酸0.1?1.0g/L,異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG) 20.0?300.0mg/L ;發酵溫度為16?40 °C ;發酵時長為12?24h ；
[0022]第四步，融合蛋白NSCR5的分離純化:將第三步獲得的產物發酵液離心收集菌體，并重懸于磷酸鹽緩沖溶液中，超聲破碎，然后再次離心收集上清液，最后將上清液過鎳離子柱并以梯度濃度咪唑洗脫，收集融合蛋白NSCR5洗出液，經透析和冷凍干燥獲得本發明目標融合蛋白NSCR5。
[0023]本發明所有的百分比含量，沒有特備指明，都屬于質量百分比含量。
[0024]有益效果
[0025]本發明新型融合蛋白集成了蜘蛛絲蛋白的自組裝性能、果蠅彈性蛋白高彈性能和硅藻R5肽的硅沉積性能，綜合性能優異，且長度均一，可完全生物降解，微生物法制備產量高、不存在化工污染。
【附圖說明】
[0026]圖1編碼NSCR5蛋白的原始基因序列
[0027]圖2為經過優化改良過的編碼NSCR5蛋白的基因序列。
[0028]圖3為圖3為融合蛋白NSCR5基因密碼子優化前后序列差異對比。