一種植物營養貯存蛋白(GmVSPB)基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物營養貯存蛋白（GmVSPB)基因，屬于遺傳工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 大豆是我國重要的糧食和油料作物，但面對耕地面積日益縮減，糧食安全問題日 益凸顯的情況，要擺脫我國大豆供給緊張，解決大豆依賴進口的嚴峻局面，必須要加快分子 育種研宄的步伐，爭取在短期內大幅度提高我國大豆的單產和總產水平。而生物技術是分 子育種的主要手段，生物技術在大豆育種中應用的一個關鍵保障就是高效穩定的再生體 系。由于大豆再生受基因型影響，只有少數大豆品種的再生體系比較穩定，因此阻礙了生物 技術在多數大豆品種中的應用。
[0003] 抑制消減雜交技術（SSH, Suppression Subtractive Hybridization)是分離 克隆差異表達基因的一種新方法，由Diatchenko等人于1996年提出的，結合了抑制PCR (Suppression PCR)技術和消減雜交法而建立的。抑制消減雜交技術（SSH)是鑒定、分離細 胞組織中的選擇性差異表達基因的一種方法，原理是以抑制性PCR為基礎的cDNA消減雜 交技術(唐江云，張濤，鄭家奎，2009)，經過抑制消減雜交后的cDNA群體不僅富集了差 異表達基因，而且目的基因間豐度的差異經過均等化作用已基本消除，消減后獲得的cDNA 群體即為豐度一致的目的基因群體(王芳，2011)。SSH技術已被國內外廣泛應用于動物和植 物研宄領域。
[0004] 大豆的組織培養研宄始于20世紀60年代，但到80年代中、后期建立了組織、細 胞、原生質體水平的植株再生技術，大豆組織培養工作真正進入了發展階段。大豆組織培養 的外植體除了原生質體和單細胞以外，常用的還有胚、子葉、子葉節、真葉及下胚軸等，有兩 種誘導途徑：一種是器官發生途徑，即通過外植體的誘導產生不定芽（或稱叢生芽），之后 芽形成不定根，最后形成完整植株；另一種體細胞胚胎發生途徑，是誘導體細胞胚胎發生， 胚萌發成再生植株。1993年，Christianson等（1993)以幼胚為外植體誘導體細胞胚胎發 生，首次獲得了再生植株。隨著研宄的發展，后來采用的外植體多為未成熟胚、下胚軸和現 在被廣泛應用于轉化的子葉節。將這些外植體培養在添加不同種類和濃度的細胞分裂素的 培養基上誘導產生不定芽后再生植株，培養基主要是MS或B5基本培養基，常用的植物激 素有6-BA、NAA、IBA和IAA等，集中研宄基因型、培養基類型、激素濃度及外植體種類等對 不定芽形成的影響。至今為止，以成熟胚子葉、子葉節和幼胚軸等作為外植體的再生體系已 經成功獲得再生大豆植株。由于大豆器官發生的外植體具有來源廣、組織培養時間短等特 點，因此僅用3個月即可得到再生大豆植株，這樣得到的再生植株嵌合體居多，篩選難度很 大，使得鑒定、篩選傳代和純化再生大豆植株的工作量大大地加大了。
[0005] 在20世紀80年代，人們發現了一種專門的貯藏蛋白，廣泛存在于營養器官中，區 別于種子IC藏蛋白，稱為植物營養IC存蛋白（vegetative storage proteins, VSP)，這種 貯藏蛋白首先是在樹木中發現的，是作為植物氮源的貯存形式而被人們認識。大豆的VSP 最早是從葉中鑒定出來，也以大豆葉中的營養貯藏蛋白質研宄得最為深入。大豆是世界上 公認的難轉化的作物，大豆的高效遺傳轉化也一直是植物基因工程領域的難點之一。國內 外相繼報道了以大豆不同組織為外植體，通過器官發生或胚胎發生以及從原生質體培養獲 得成功的再生植株，但突破性的進展卻很少，即轉化率還沒有顯著提高。這種情況大大影響 了大豆轉基因技術的應用，所以大豆轉基因技術研宄的重心應該轉移到大豆高效再生體系 的建立及大豆再生相關基因發生機理和調控因子方面，通過優化再生條件及分析再生基因 的功能進而提高大豆的再生能力，為建立高效、穩定的再生體系和遺傳轉化體系奠定基礎。 再生相關基因還能夠以一種新型無爭議的生物安全標記基因來替代抗生素、除草劑等選擇 標記，在導入外源目的基因的同時提高受體植物的再生能力，對植物轉基因育種效率及轉 基因新品種的安全性具有重要意義。目前，雖然對植物的再生相關基因的研宄較少，但在模 式植物擬南芥、水稻等植物中已有一些調控再生相關的轉錄因子或基因的研宄和報道，可 為本研宄奠定一定的理論保證。關于植物再生相關基因的克隆在國內外報道甚少，而大豆 再生相關基因的克隆更是未見報道，因此，如何通過現代分子生物學技術從根本上提高大 豆的再生能力，找到控制大豆再生的基因，解決大豆再生體系建立難、轉化難成為急需解決 的一大難題？所以以大豆東農50子葉節為材料，在細胞分裂素6-BA誘導下，抑制消減雜交 出差異基因，獲得再生相關基因并進行基因克隆，利用農桿菌介導的方法轉化植物，觀察轉 基因植株的變化，通過定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研宄細胞分裂素對再生的影 響；從子葉節器官發生途徑結合激素對大豆再生途徑相關轉錄因子基因的表達影響入手， 分析再生基因在再生體系中的作用，尋找再生基因并對基因進行克隆和改造；從分子水平 上分析基因的功能并研宄其作用機理，為發掘大豆再生基因，提高大豆的再生和遺傳轉化 效率，發明一種植物營養貯存蛋白（GmVSPB)基因是必要的。
【發明內容】
[0006] 為了通過現代分子生物學技術試圖從根本上提高大豆的再生能力，解決大豆再生 體系建立難、轉化難的難題，本發明提供了一種植物營養貯存蛋白（GmVSPB)基因，該發明以 大豆東農50子葉節為材料，在細胞分裂素6-BA誘導下，抑制消減雜交出差異基因，以期獲 得再生相關基因并進行基因克隆，利用農桿菌介導的方法轉化植物，觀察轉基因植株的變 化，通過定量RT-PCR方法初步分析基因的功能，研宄細胞分裂素對再生的影響；從子葉節 器官發生途徑結合激素對大豆再生途徑相關轉錄因子基因的表達影響入手，分析再生基因 在再生體系中的作用，尋找到大豆植物營養貯存蛋白（GmVSPB)基因 （Seq ID No: 1)。
[0007] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是： 本發明的一種一種植物營養貯存蛋白（GmVSPB)基因，其特征在于采用抑制消減雜交法 獲得GmVSPB基因 （Seq ID No: 1)。具體步驟如下： 本發明的一種植物營養貯存蛋白（GmVSPB)基因，其特征在于采用抑制消減雜交法 獲得GmVSPB基因 （Seq ID No: 1)。具體步驟如下：①抑制消減雜交法：首先，獲得大豆子 葉節并用6-BA處理；接著，用RNAiso Plus的方法提取大豆子葉節的總RNA，采用SMART (Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript)技術合成cDNA，純化雙鏈cDNA， 純化RsaI酶切及其產物，接頭連接，雜交，分析消減雜交后兩次PCR擴增的結果，純化PCR 產物，構建抑制消減雜交文庫，最后，克隆基因 （Seq ID No: 1)并對其序列分析。 ②GmVSPB基因的生物信息學分析（Seq ID No:2)。③GmVSPB基因的植物表達載體構建。 ④中間載體的構建。⑤GmVSPB植物表達載體轉化農桿菌：利用凍融法將物表達載體質粒轉 入農桿菌菌株。轉化后挑取單菌落搖菌，提取質粒。通過PCR擴增獲得條帶大小為977bp， 表明成功將表達載體轉化到農桿菌中。I.農桿菌的制備及轉化農桿菌感受態的制 備；ii.農桿菌轉化子的鑒定。⑥子葉節法轉化大豆：將目的基因 GmVSPB基因轉入植物體 中。II.子葉節法轉化大豆：i.轉化中用到的培養基；ii.大豆種子滅菌劑子葉節外植體 的獲得：①侵染與共培養；②叢生芽的誘導及篩選；③抗性芽的伸長和生根；④抗性植 株的馴化。⑦轉基因植株的檢測轉基因大豆DNA的提取：SDS小量法提取植物總DNA ; Π .轉基因植株的PCR鑒定；III.過表達大豆的檢測。⑧GmVSPB基因的組織特異性表達： 結果表明命KS/想基因在子葉中表達量最高，其次是莖、根，可推測該基因在子葉再生，莖的 伸長中發揮一定的作用。
[0008] 本發明的有益效果為:一種植物營養貯存蛋白（GmVSPB)基因發現①利用抑制 消減雜交的方法，以大豆DN50的子葉節為材料，以細胞分裂素6-BA作為誘導條件，構建了 大豆再生相關基因的cDNA消減文庫。②克隆獲得GmVSPB基因，并成功構建了 GmVSPB基因 的植物表達載體。GmVSPB基因 （Seq ID No: 1)的765bp的⑶S區共編碼254個氨基酸序列 (Seq ID No:2)，其分子量為29. 28041kDa，理論等電點PI為6. 72。③利用農桿菌的介導，采 用子葉節法將GmVSPB基因的植物表達載體進行大豆的遺傳轉化。④Real-time RT-PCR分 析表明，GmVSPB在大豆根、真葉、三出復葉、莖、花芽、中均有表達，但表達具有組織特異性， 對大豆子葉再生和莖伸長表現最明顯。⑤Real-time RT-PCR分析表明，GmVSPB的表達受 6-BA的調控誘導，在6-BA處理2h后表達量開始持續上升，在8h時達到峰值，而后又逐漸 下降。
【附圖說明】