] 26.根據3、4、5、6和11至25中任一項所述的CBH變體，其中所述變體進一步包含 T41I置換。
[0045]在某些實施例中，親本CBH為真菌纖維二糖水解酶1 (CBH1)，例如來自以下各項 的CBH1:紅褐肉座菌（Hypocreajecorina)、東方肉座菌（Hypocreaorientalis)、施韋尼 茲肉座菌（Hypocreaschweinitzii)、桔綠木霉（Trichodermacitrinoviride)、擬康氏 木霉（Trichodermapseudokoningii)、康長木霉（Trichodermakonilangbra)、哈茨木霉 (Trichodermaharzanium)、棘抱曲霉(Aspergillusaculeatus)、黑曲霉（Aspergillus niger)、微紫青霉菌（Penicilliumjanthinellum)、灰腐質霉（Humicolagrisea)、嗜熱色 串抱（Scytalidiumthermophilum)和柄抱霉（Podosporaanderina)(或其相應的無性型、 有性型或全型對應形式），例如選自SEQIDNO: 3至15中的任一者的CBH1。在某些實施例 中，親本CBH與SEQIDN0:3具有至少90%序列同一性，例如至少95%序列同一性。
[0046] 本發明的方面包括分離的多核苷酸，其包含編碼如本文所述的親本CBH的變體 的多核苷酸序列。所述分離的多核苷酸可存在于載體中，例如表達載體或用于多核苷酸 增殖的載體。載體可存在于使載體增殖和/或表達如本文所述的所編碼CBH變體的宿 主細胞中。宿主細胞可為可用于使CBH變體多核苷酸增殖和/或表達所編碼CBH變體 的任何細胞，例如細菌細胞、真菌細胞等。可采用的合適真菌細胞類型的例子包括絲狀真 菌細胞，例如以下各項的細胞：里氏木霉、長枝木霉（Trichodermalongibrachiatum)、綠 色木霉（Trichodermaviride)、康寧木霉（Trichodermakoningii)、哈茨木霉、青霉屬 (Penicillium)、腐質霉屬（Humicola)、特異腐質霉（Humicolainsolens)、灰腐質霉、金孢 子菌屬（Chrysosporium)、魯克文金抱子菌（Chrysosporiumlucknowense)、嗜熱毀絲菌 (Myceliophthorathermophila)、粘帚霉屬（Gliocladium)、曲霉菌屬（Aspergillus)、鏡抱 屬（Fusarium)、脈胞菌屬（Neurospora)、肉座菌屬（Hypocrea)、翹孢霉屬（Emericella)、黑 曲霉、泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、棘抱曲霉和構巢曲霉（Aspergillusnidulans)。 或者，真菌宿主細胞可為酵母細胞，例如釀酒酵母、裂殖酵母（Schizzosaccharomyces pombe)、西方許旺酵母（Schwanniomycesoccidentalis)、乳酸克魯維酵母（Kluveromyces lactus)、產|元假絲酵母（Candidautilis)、白假絲酵母（Candidaalbicans)、具柄畢赤 酵母（Pichiastipitis)、畢赤酵母（Pichiapastoris)、解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica)、多形漢遜酵母（Hansenulapolymorpha)、紅發夫酵母（Phaffiarhodozyma)、 Arxulaadeninivorans、漢遜德巴利酵母（Debaryomyceshansenii)或多形德巴利酵母 (Debaryomycespolymorphus)〇
[0047] 本發明的方面包括產生變體CBH的方法，其包括在由多核苷酸表達（或產生）CBH 變體的合適培養基中、在合適條件下培養含有編碼CBH變體的多核苷酸的宿主細胞，例如 其中所述編碼CBH變體的多核苷酸存在于表達載體中（即其中CBH變體編碼多核苷酸可操 作地連接至驅動CBH變體在宿主細胞中的表達的啟動子。在某些實施例中，所述方法進一 步包括分離所產生的CBH變體。
[0048] 本發明的方面還包括含有如本文所述的CBH變體的組合物。合適的組合物的例子 包括但不限于洗滌劑組合物、飼料添加劑和用于處理（或水解）纖維素底物（例如含有纖 維素的紡織品，例如粗斜紋布；含有纖維素的生物質材料，例如已任選地經受水解前加工預 處理的木質纖維素生物質材料的混合物等）的組合物。包含如本文所述的CBH變體和纖維 素底物的組合物代表本發明的另外方面。含有CHB變體的洗滌劑組合物包括洗衣洗滌劑和 碗碟洗滌劑，其中此類洗滌劑可進一步包含其他組分，例如表面活性劑。合適纖維底物的例 子包括但不限于草、柳枝稷、繩草、黑麥草、草蘆、芒草、糖加工殘余物、甘蔗渣、農業廢物、稻 草、稻殼、大麥秸、玉米芯、谷草、小麥秸、油菜秸、燕麥秸、燕麥殼、玉米纖維、稿桿、大豆桿、 玉米桿、林業廢物、木漿、循環利用的木漿纖維、造紙污泥、鋸肩、硬木材、軟木材和其組合。
[0049] 本發明的方面包括用于水解纖維底物的方法，其包括使所述底物與如本文所述的 變體CBH相接觸。在某些實施例中，以不含細胞的組合物形式提供CBH變體，而在其他實施 例中，以宿主細胞組合物形式提供CBH變體，其中宿主細胞表達CBH變體。因此，用于水解 纖維素底物的方法的某些實施例包括使所述底物與含有CBH變體表達載體的宿主細胞相 接觸。在某些實施例中，所述方法用于將木質纖維素生物質轉化成葡萄糖，其中在這些實施 例的一些中，木質纖維素生物質選自但不限于：草、柳枝稷、繩草、黑麥草、草蘆、芒草、糖加 工殘余物、甘蔗渣、農業廢物、稻草、稻殼、大麥秸、玉米芯、谷草、小麥秸、油菜秸、燕麥秸、燕 麥殼、玉米纖維、稿桿、大豆桿、玉米桿、林業廢物、木漿、循環利用的木漿纖維、造紙污泥、鋸 肩、硬木材、軟木材和其組合。在某些其他實施例中，纖維素底物為含有纖維素的紡織品，例 如粗斜紋布，其中在這些實施例的一些中，所述方法用于處理靛青染色的粗斜紋布（例如 在石磨洗過程中）。
[0050] 本發明的方面包括含有如本文所述的CBH變體的細胞培養上清液組合物。例如， 通過以下獲得細胞培養上清液：在由多核苷酸表達CBH變體并且將CBH變體分泌到細胞 培養上清液中的合適培養基中、在合適條件下培養含有編碼CBH變體的多核苷酸的宿主細 胞。此類細胞培養上清液可包含宿主細胞產生的其他蛋白質和/或酶，包括內源性和/或外 源性表達的蛋白質和/或酶。培養基的此類上清液可原樣使用，進行最低或不進行產生后 處理，所述處理可典型地包括過濾以去除細胞碎片，細胞殺傷程序和/或超濾或其他步驟， 以增濃或濃縮其中的酶。此類上清液在本文中稱為"全發酵液"或"全纖維素酶發酵液"。
[0051] 可通過與一種或多種其他纖維素酶和/或一種或多種半纖維素酶共表達來產生 CBH變體。或者，可在沒有其他纖維素酶或半纖維素酶的情況下產生CBH變體。在后一種情 況下，CBH變體任選地可與一種或多種其他纖維素酶和/或一種或多種半纖維素酶進行物 理混合，以形成可用于特定應用的酶組合物，例如可用于水解木質纖維素生物質底物。
[0052] 還涵蓋含有所需變體纖維素酶的其他組合物以及此類組合物的使用方法。
【附圖說明】
[0053] 圖1A和1B示出來自紅褐肉座菌的野生型Cel7A(CBHl)的核酸序列（頂部線）（SEQ IDN0:1)和氨基酸序列（底部線）（SEQIDN0:3)。
[0054] 圖2A、2B、2C以及2D示出源自紅褐肉座菌（SEQIDN0:3)、東方肉座菌（SEQID N0:4)、施韋尼茲肉座菌（SEQIDN0:5)、桔綠木霉（SEQIDN0:6)、擬康氏木霉（SEQID 勵:7)、康長木霉（5￡〇10勵:8)、哈茨木霉（5￡〇10勵:9)、棘孢曲霉（5￡〇10勵：10)、黑 曲霉（SEQIDNO: 11)、微紫青霉菌（SEQIDNO: 12)、灰腐質霉（EQIDNO: 13)、嗜熱色串孢 (SEQIDNO: 14)和柄孢霉（SEQIDNO: 15)的成熟形式的CBH酶的氨基酸比對。頂部的編號 指示成熟形式的紅褐肉座菌的氨基酸編號。同一、保守和半保守的氨基酸分別用星號（*)、 冒號（:）和句點（.）指示。
[0055] 圖3為表達載體pTTT-pyrG-cbhl的示意性圖示。
[0056] 圖4示出展現出顯著的解鏈溫度變化（ATm)的CBH置換變體。ATm處于X軸，其 中具有顯著ATm的各特異性變體示出在其ATm值處。截距值指示模型對于沒有置換的分 子（即野生型）的ATm的預測。
[0057] 圖5示出在whPCS測定中展現出顯著的性能指數變化（API)的CBH置換變體。 API處于X軸（標記為"whPCSPI的收益"），其中具有顯著API的各特異性變體示出在 其近似API值處。截距值指示模型對于沒有置換的分子（即野生型）的API的預測。
[0058] 圖6示出在daCS測定中展現出顯著的性能指數變化（API)的CBH置換變體。API 處于X軸（標記為"daCSPI的收益"），其中具有顯著API的各特異性變體示出在其近似 API值處。截距值指示模型對于沒有置換的分子（即野生型）的API的預測。
[0059] 圖7示出在PASC測定中展現出顯著的性能指數變化（API)的CBH置換變體。API 處于X軸（標記為"daCSPI的收益"），其中具有顯著API的各特異性變體示出在其近似 API值處。截距值指示模型對于沒有置換的分子（即野生型）的API的預測。
[0060] 圖8A、8B和8C示出來自紅褐肉座菌、含有本文所述的氨基酸置換的CBH1氨基酸 序列（SEQIDN0:16)。標號"Xaa"指示可進行不止一個置換的氨基酸位置。在圖8C的底 部指示這些Xaa位點處的置換（在位置200、246和255處）。置換的氨基酸位置以粗下劃 線示出。
【具體實施方式】
[0061] 現將僅通過參考使用以下定義和實例來詳細描述本發明。本文提及的所有專利和 出版物，包括在這些