組合物及使用方法
【專利說明】
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年12月7日提交的國際專利申請PCT/CN2012/086179的優先權， 將該國際專利申請以引用方式全文并入本文。
技術領域
[0003] 本組合物和方法涉及源自褐色喜熱裂孢菌（Thermobifidafusca)的|3 -甘露聚 糖酶、編碼甘露聚糖酶的多核苷酸以及它們的生產和使用方法。含有重組甘露聚 糖酶的制劑具有廣泛的用途，例如用于水解某些軟木類型的木質纖維素材料和/或包含半 乳葡甘露聚糖（GGM)和/或葡甘露聚糖（GM)的木質纖維素生物質底物。
【背景技術】
[0004] 纖維素和半纖維素是通過光合作用產生的最豐富的植物材料。它們可被多種產生 能夠將聚合物底物水解成單體糖類的胞外酶的微生物（例如，細菌、酵母和真菌）降解和 用作能源（Aro等人，（2001)，J.Biol.Chem.(《生物化學雜志》），276:24309-24314)。因為 非可再生資源方法的局限性，纖維素成為主要可再生能源的潛能是巨大的（Krishna等人， (2001)，BioresourceTech.(《生物資源技術》），77:193-196)。通過生物過程有效利用 纖維素是克服食品、飼料和燃料短缺的一種途徑（Ohmiya等人，（1997)，Biotechnol.Gen. EngineerRev.(《生物技術和遺傳工程評論》），14:365-414)。
[0005] 木質纖維素生物質材料的酶促水解大多集中于纖維素酶，其為水解纖維素（包含 0-1，4-葡聚糖或0D-葡糖苷鍵）而導致形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖等的酶。傳統上 將纖維素酶分為三大類：內切葡聚糖酶（EC3. 2. 1. 4) ( "EG")、外切葡聚糖酶或纖維二糖水 解酶（EC3. 2. 1. 91) ("CBH"）和0 -葡糖苷酶（[f3 ]-D-葡糖苷葡糖水解酶；EC3. 2. 1. 21) ("BG"）（Knowles等人，（1987)，TIBTECH，5:255-261 ;以及Schulein，（1988)，Methods Enzymol.(《酶學方法》），160:234-243)。內切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的非晶部分， 而纖維二糖水解酶還能夠降解結晶纖維素（Nevalainen和Penttila，1995年，Mycota(《菌 界》)，303-319)。因此，纖維二糖水解酶在纖維素酶體系中的存在是結晶纖維素有效溶解所 必需的（Suurnakki等人，（2000)，Cellulose(《纖維素》），7:189-209)。0-葡糖苷酶起到 從纖維二糖、纖維低聚糖和其他葡糖苷釋放D-葡萄糖單元的作用（Freer，（1993)，J.Biol. Chem.(《生物化學雜志》），268:9337-9342)。
[0006] 但是，為了從木質纖維素生物質材料獲得有用的可發酵糖，木質素通常將首先需 要例如通過各種預處理方法進行透化，并且使半纖維素破壞以便纖維素酶接觸到纖維素。 半纖維素具有復雜的化學結構，它們的主鏈由甘露聚糖、木聚糖和半乳聚糖組成。甘露聚糖 類型的多糖存在于多種植物和植物組織中，例如存在于植物的種子、根、鱗莖和塊莖中。這 類糖可包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖，并且它們通常含有直鏈0 -1，4-連接 的甘露糖單元和/或半乳糖單元構成的直鏈和散布鏈（interspersedchain)。大多數類型 的甘露聚糖不溶于水中，從而形成某些植物組織（如棕櫚仁和象牙椰子）的硬度特性。另 一方面，半乳甘露聚糖往往可溶于水中，并且存在于豆科植物的種子胚乳中且據信有助于 保持這些種子中的水。
[0007] 復雜的木質纖維素結構和相當頑拗的植物細胞壁的酶促水解涉及許多不同的內 切酶和外切酶（例如纖維素酶和半纖維素酶）的協同和/或相續的作用。木聚糖酶和 0-甘露聚糖酶是內切酶，而甘露糖苷酶、葡糖苷酶和a-半乳糖苷酶是外切酶。 為破壞半纖維素，可將木聚糖酶與其他輔助蛋白（其非限制性例子包括L-a_阿拉伯呋喃 糖苷酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡萄糖醛酸酶和木糖苷酶）一起應用。
[0008] 內切-1,4-0-D-甘露聚糖酶（E.C. 3. 2. 1.78)催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘 露聚糖和半乳葡甘露聚糖的主鏈中的0-1，4-甘露糖苷鍵的隨機水解，釋放出短鏈和長鏈 寡甘露糖苷。短鏈寡甘露糖苷可包括甘露二糖和甘露三糖，不過有時候也可包括一些甘露 糖。這些短鏈寡甘露糖苷可被0 _甘露糖苷酶（E.C. 3. 2. 1. 25)進一步水解。另外，雜多糖 的側鏈糖可例如通過a-半乳糖苷酶、葡糖苷酶和/或通過乙酰甘露聚糖酯酶進一步 水解至完全。PulsJ.，（1997)，Macromol.Symp.(《大分子評論集》）120:183-196。
[0009] 已從細菌、真菌、植物和動物分離了 甘露聚糖酶。參見AraujoA.等人， (1990)，J.App.Bacteriol.(《應用細菌學雜志》）68:253-261;DuttaS.等人，（1997)，PlantPhysiol.(《植物生理學》）113:155-161;PucharV.等人，（2004)Biochim.Biophys. Acta(《生物化學與生物物理學學報》）1674:239-250。還已克隆了來自多種生物體的編碼 這些酶的基因并進行了測序，基于它們的序列，它們中許多（如果不是全部的話）也已被歸 類為糖基水解酶（GH)家族5或者26的成員。參見例如BewleyD.J.，（1997)，Planta(《植 物》)203:454-459;HalsteadJ.R.等人，（2000)，FEMSMicrol.Lett.(《歐洲微生物學會聯 合會微生物學快報》）192:197-203;XuB.等人，（2002)，Eur.J.Biochem.(《歐洲生物化學雜 志》）269:1753-1760 ;Henrissat，B.，（1991)，Biochem.J.(《生物化學雜志》）280:309-316〇 盡管大多數甘露聚糖酶由其來源生物分泌，但有一些已知與細胞結合。從一給定的生 物體，可能有不止一種源自不同的基因或者相同基因的不同產物、具有不同的等電點的甘 露聚糖酶，這個事實據信是這些酶的重要性的指示。
[0010] e-甘露聚糖酶已在商業應用中使用，例如在諸如紙張和紙漿行業、食品和飼料行 業、醫藥行業和能源行業之類的行業中使用。LeeJ.T.等人，（2003)，Poult.Sci.(《禽類 科學》），82:1925-1931;McCutchenM.C.等人，（1996)，Biotechnol.Bioeng.(《生物技術與 生物工程》）52:332_339;311111'仙1^1八.等人，（1997)，八(1￥.13;[0(3116111.￡叩.13;[0七6(3111101.(《生 物化學工程與生物技術進展》)57:261-287。但是，取決于甘露聚糖酶的來源微生物，不同的 0 -甘露聚糖酶可具有不同的性質和活性譜（activityprofile)，這些不同的性質和活性 譜可能使它們更適合于一種或多種工業應用而不適合于其他工業應用。木質纖維素生物質 底物（尤其是來自植物來源的那些木質纖維素生物質底物）的水解眾所周知是困難的，因 此，已被發現可用于其他工業應用的甘露聚糖酶中很少（如果有的話）已被用來水解木質 纖維素材料。
[0011] 因此，對于鑒定這樣的甘露聚糖酶和/或包含這種酶的組合物存在著需求，所述 甘露聚糖酶和/或組合物與市售的、新鑒定的或者工程改造的纖維素酶和其他半纖維素酶 聯合，可有效地并能夠將多種基于植物的和/或其他的纖維素或者半纖維素材料轉化成可 發酵糖，同時具有足夠的或者改善的效力、改善的可發酵糖產率和/或改善的作用于多種 多樣的纖維素原料的能力。使用工程改造的微生物產生新的甘露聚糖酶也是重要的和合乎 期望的，因為這些是可能高成本效益地制備酶的手段。
【發明內容】
[0012] 本組合物和方法的一個方面是應用或者使用從褐色喜熱裂孢菌（Thermobifida fusca)菌株YX這個細菌物種分離的高活性甘露聚糖酶（TfuManl)來水解木質纖維素 生物質底物。本文描述的SEQIDN0:2的序列由LykidisA.等人作為褐色喜熱裂孢菌的 基因組序列的一部分提交和公布至J.Bacteriol.(《細菌學雜志》）（2007) 189(6) : 2477-86 ; 以及由Copeland等人、由DOEJointGenomeInstitute提交和公布至NCBI，為其指定登錄 號YP_288961。該序列由NCBI命名為內切-1，4-0 -甘露糖苷酶，但迄今尚未被重組表達、 以工業或商業上相關的量表達或應用于工業應用。TfuManl多肽尚未由經工程改造的微生 物表達。它們也尚未與一種或多種纖維素酶基因和/或一種或多種半纖維素酶一起共表達 或與一種或多種纖維素酶基因和/或一種或多種半纖維素酶一起包括在組合物中。
[0013] 因此本發明的一個方面是這樣的發現，即與SEQIDN0:2或者與成熟序列SEQID NO: 3 (其為SEQIDNO: 2的殘基29-453)具有至少65% (例如至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少91%、至少92%、至少93%、至少 94%、至少95 %、至少96%、至少97 %、至少98 %、至少99 %或更高）同一性的多肽具有 甘露聚糖酶活性。本發明的另一個方面是這樣的發現，即當這樣一種多肽與一種或多 種纖維素酶和/或一種或多種其他半纖維素酶組合時可賦予該組合物或混合物改善的水 解木質纖維素生物質底物的能力。這種改善包括例如選自以下的性質中的一者或多者：葡 聚糖轉化提高、從給定的生物質底物得到葡萄糖的產率提高、木聚糖轉化提高、木糖產率提 高、從給定的生物質底物得到總可溶性糖的產率提高、在某一固形物水平下的給定生物質 底物的液化更加快速以及在某一固形物水平下的生物質底物的粘度降低更加快速。改善還 可包括這樣的出乎意料的發現，即這種多肽當與任選還包含一種或多種其他半纖維素酶的 纖維素酶混合物或者組合物進行組合時，可用于增強纖維素生物質的轉化和水解。所得的 包含TfuManl多肽的混合物與具有相同濃度/比例/量的所有其他酶但不具有TfuManl 的對等混合物相比，具有改善的水解性能。在一些實施例中，TfuManl多肽可替代例如高 達約20重量％ (例如高達約20重量％、高達約18重量％、高達約16重量％、高達約14重 量％、高達約12重量％、高達約10重量％、高達約8重量％、高達約5重量％等）的纖維素 酶混合物或者組合物，并且該替代的組合物當用于水解給定的木質纖維素生物質底物時將 保留其能力和水解性能，或者甚至與未被取代的但具有相同酶組成和相同總蛋白的對等纖 維素混合物或者組合物相比具有改善的水解（例如較高的葡聚糖和/或木聚糖轉化率、較 高的總糖產量、較快的液化和/或改善的粘度降低）。
[0014] 本組合物和方法的一個方面涉及源自褐色喜熱裂孢菌的糖基水解酶家族5的 0-甘露聚糖酶多肽（在本文中稱為"TfuManl"或者"TfuManl多肽"）、編碼所述酶多肽 的核酸、包含所述酶多肽的組合物以及制備所述0_甘露聚糖酶多肽及包含其的組合物并 將它們應用于水解或者轉化木質纖維素生物質為可溶性可發酵糖的方法。特別合適的木質 纖維素生物質材料是那些含有半乳葡甘露聚糖（GGM)和/或葡甘露聚糖（GM)的木質纖維 素生物質材料然后可將此類可發酵糖轉化成纖維素乙醇、燃料以及其他生物化學物質和可 用產物。在某些實施例中，甘露聚糖酶多肽當與包含至少一種纖維素酶或至少一種其他 半纖維素酶的酶混合物或者與包含至少一種纖維素酶和至少一種其他半纖維素酶的酶混 合物進行組合時，所得到的酶混合物與例如來自各種微生物的、具有類似的最佳pH和/或 類似的最佳溫度的其他0 _甘露聚糖酶相比，能夠具有提高的或者增強的水解木質纖維素 生物質材料的能力。
[0015] 這種提高的或者增強的水解木質纖維素生物質材料的能力例如反映在以下方面： 不僅由經某種方式預處理的給定木質纖維素生物質底物的酶促水解所產生的總可溶性糖 的產量極大地提高，而且出乎意料的是葡萄糖的產量也提高（反映較高的葡聚糖轉化率） 和/或木聚糖的產量也提高（反映較高的木聚糖轉化率）。
[0016] 該提高的或者增強的水解木質纖維素生物質材料的能力，也可反映在這種酶組合 物改善或者加速經預處理的生物質材料的液化和/或降低其粘度的合乎期望的能力。如果 使用高固形物水平的生物質材料作為底物的話，這種粘度/液化有益效果是最顯著的。當 使用該酶組合物/混合物來分解或者水解往往具有高度纖維性和頑拗性（recalcitrant) (這種性質導致特別粘稠的原料）的木材生物質時，這種粘度/液化有益效果也是巨大和重 要的。<