通過在釀酒酵母中的表達產生可分泌抗體的方法
【專利說明】通過在釀酒酵母中的表達產生可分泌抗體的方法
[0001] 發明豐題 本發明涉及用于在釀酒酵母（cererisiae)細胞的表面上產生和非共 價表面呈遞抗體和衍生片段以及基于其的分子文庫的方法。表面呈遞的非共價方式使得可 能借助高通量篩選選擇特定變體和隨后所選結合分子可切換分泌至培養上清液用于生化 表征。
[0002] 本發明還涉及用于在酵母細胞的表面上呈遞抗體或抗體文庫和篩選這些文庫的 具有特別期望特性的免疫球蛋白的方法。
[0003] 發明背景 單克隆抗體的發現已經從雜交瘤技術進化，在其幫助下，可以以特異性方式產生具有 特定特異性和親和力的抗體。由其開發的組合文庫，包括篩選和選擇方法，已經發展成標準 工具，用于通常修飾蛋白的結合特性。
[0004] 用于生成和篩選抗體文庫的最普遍的技術曾經是"噬菌體呈遞"方法，并且在一些 情況下仍然是"噬菌體呈遞"方法，其中特定目標蛋白可以在噬菌體外殼蛋白上表達為融合 多肽，并且通過結合至固定或可溶性生物素化的配體而選擇。已經以這種方式構建的噬菌 體可被視為緊湊遺傳單元，其已經在表型和基因型特性兩者方面自身組合。抗體、抗體片 段、酶、DNA結合蛋白等上已經非常成功地使用噬菌體呈遞。通過在稱為"淘選"的過程中結 合至固定抗原選擇具有期望結合特性的抗體。洗出含有非特異性抗體的噬菌體，將結合的 噬菌體分離且在大腸桿菌中擴增。該設置已用于生成大量抗原特異性抗體。盡管如此，噬 菌體呈遞技術具有一些基本缺陷和困難，其限制了其用途，特別是在真核蛋白的產生中。因 此，例如，可以分離非常高親和力的抗體，并且僅困難地通過"淘選"進一步處理。此外，可 以影響抗體的特異性和親和力的翻譯后修飾，諸如例如糖基化，用噬菌體呈遞方法是不可 能的。
[0005] -種替代方案是使用低等真核系統，諸如酵母。與在絲狀噬菌體的情況下相比， B細胞呈遞抗體和酵母細胞呈遞抗體之間的結構相似性使得更接近類似于體內"親和力成 熟"。因為具體地真核細胞諸如酵母能夠產生糖基化蛋白，而絲狀噬菌體不能做到這一點， 來自真核宿主細胞的單克隆抗體應當具有比來自噬菌體的抗體更類似于人或哺乳動物的 特性。此外，在酵母中克隆、表達和修飾抗體特別已經證明在方法和實用性方面是有效和簡 單的。US 6, 699, 658描述了，例如，酵母細胞表面呈遞方法，在其幫助下，組合抗體文庫的篩 選和生產已經變得可能。所述"酵母表面呈遞"技術基于用表達融合至酵母細胞壁蛋白的 免疫球蛋白的載體轉染酵母細胞，采用誘變以便生成免疫球蛋白變體的多樣性且以便然后 根據期望表型特性選擇這些細胞。該技術由Boder和Wittrup在1997年建立。他們首次 成功地在酵母細胞的表面上功能呈遞組合文庫的scFv片段，通過流式細胞術篩選它們，并 且分離對于抗原具有增加親和力的scFv片段。基因型和表型的穩定偶聯使其變得可能，因 為scFv片段被呈遞為具有酵母固有的細胞壁蛋白的融合蛋白。據推測，通過使用基于酵母 的呈遞技術實現的最重要成就是熒光激活的細胞分選（FACS)的直接適用性，這在有效篩 選大變體文庫中是決定性的。穩定的基因型-表型偶聯通過異源蛋白與釀酒酵母的外細 胞壁的蛋白的融合來實現。由此實現的蛋白暴露是與抗原相互作用的前提條件。
[0006] 然而，如Wittrup和Boder開發的剛剛描述的酵母表面呈遞特別具有一些實際缺 點。一個缺點是，例如，各種表達的蛋白無法獲得，或者只能用相同的酵母細胞不令人滿意 地獲得。此外，通過Wittrup的方法，期望的免疫球蛋白共價結合至細胞壁蛋白，并且必須 通過另外的方法步驟進行分離。
[0007] W0 2010/005863描述了基于巴斯德畢赤酵母種的酵母細胞的相應酵母表面呈遞 系統，其中免疫球蛋白非共價地結合至蛋白A的ZZ結構域，其中當用于表達所述蛋白的相 應多種啟動子以正確的時間順序開啟或關閉時，包含細胞壁蛋白凝集素或其亞單位和ZZ 結構域和免疫球蛋白的融合蛋白僅在酵母細胞中同時表達且分泌，以便被呈遞在細胞表面 上。
[0008] 發明概沐 本發明涉及開發用于在酵母種釀酒酵母細胞的表面上非共價表面呈遞抗體和衍生片 段以及基于其的分子文庫的方法。表面呈遞的非共價方式意欲使得可能借助高通量篩選選 擇特定變體和隨后所選結合分子可切換分泌至培養上清液用于生化表征。
[0009] 焦點是選擇和生產的成功組合，其節約時間地省略亞克隆和重新格式化步驟，諸 如在已知相當方法中必需的步驟，諸如例如噬菌體上的蛋白表面呈遞。該組合導致抗體的 活性成分發現中的后續過程的簡化和加速。通過本身已知的使用Fc結合結構域、優選來自 金黃色葡萄球菌蛋白A的ZZ結構域作為表面呈遞的介體，可以在酵母細胞上成功地呈遞抗 體、生物活性抗體片段和抗體結構域，諸如，例如，VHH-Fc融合蛋白（由兩條蛋白鏈組成）。
[0010] 令人驚訝地，通過使用酵母釀酒酵母作為宿主生物體，在表面呈遞過程中已經選 擇蛋白的正確折疊、分泌和穩定性，因為作為真核生物，該酵母在蛋白合成過程中具有質量 控制的機制。通過此處呈現的方法，可以在酵母細胞的表面上以對其用途特異性的最終形 式呈遞VHH-Fc融合蛋白和更復雜的蛋白，諸如整個抗體，并且以這種方式，能夠使用蛋白 工程改造的方法。其后，所選克隆可以直接用于產生蛋白。
[0011] 因此，本發明提供用于通過表達、分泌和將其呈遞在酵母細胞的表面上而產生多 種IgG分子，諸如抗體、生物活性抗體片段或具有特定特性的抗體結構域的方法，其中根據 本發明的方法包括以下步驟： (a) 提供酵母種釀酒酵母的宿主細胞，其已經用合適質粒的形式的第一和第二核酸分 子轉染，其中所述第一核酸分子編碼融合蛋白，所述融合蛋白基本上包含細胞表面錨定蛋 白、Fc結合結構域和可調節啟動子，所述可調節啟動子根據培養條件控制所述融合蛋白的 表達，并且所述第二核酸分子編碼所述抗體群體，所述抗體片段或抗體結構域呈其輕鏈和 重鏈的形式，并且在永久活性啟動子的控制下， (b) 通過在培養基中存在具有> 5, 000的分子量的聚乙二醇（PEG)的情況下在酵母細 胞中同時共表達多種抗體、抗體片段或抗體結構域而表達所述融合蛋白，其中所述IgG分 子以及融合蛋白以可溶性形式從酵母細胞分泌， (c) 在所述酵母細胞的表面上呈遞多種抗體、抗體片段或抗體結構域，其以非共價形 式結合至表達的錨定至細胞表面的融合蛋白的Fc結合結構域， (d) 根據結合至Fc結合結構域的多種抗體、生物活性抗體片段或抗體結構域的期望 的不同的表型或結合特性，在結合至融合蛋白或Ig分子或其中含有的檢測標記的幫助下 選擇和分離酵母細胞， (e) 在不允許或基本不允許進一步表達融合蛋白的培養條件下在特定選擇的酵母細 胞群體中表達多種抗體、生物活性抗體片段或抗體結構域，和 (f) 從培養基分離具有所選表型或結合特性的多種抗體。
[0012] 與此相反，在根據W0 2010/0058863的方法中，在巴斯德畢赤酵母中表達本身相 同的融合蛋白和免疫球蛋白不同時進行：反而，該系統只有當通過活化負責的啟動子誘導 和操作細胞表面"捕獲"分子的表達才在一定程度上有效地發揮作用，而沒有同時發生免疫 球蛋白的輕鏈和重鏈的值得注意的表達。在捕獲分子的表達已經由于經由可調控啟動子抑 制而停止之后，這僅在第二步驟中實現。
[0013] 令人驚訝地，這在根據本發明的方法中是不必要的。盡管初始活化Fc結合結構域 的啟動子，Ig分子的表達已經可以同時發生。當Fc結合結構域已經在酵母細胞中充分表 達和分泌時，為了最終結合至細胞表面，且同時共表達和共分泌Ig，在Fc結合結構域的啟 動子已經關閉后，Ig分子的表達繼續發生，并且這些在其分泌后非共價結合至游離的Fc結 合結構域。這完全更令人驚訝，因為在W0 2010/0058863中，原則上采用相同或非常相似的 細胞壁表面蛋白（作為錨定蛋白）和相同的Fc結合結構域（ZZ結構域）。根據本發明的 方法中的差異因此似乎在于不同的酵母種（釀酒酵母相比于巴斯德畢赤酵母）和使用較高 分子量聚乙二醇。已經發現，使用具有> 5, 000、特別是> 6, 000、特別是> 7, 000且優選〉 8, 000的分子量的PEG導致細胞表面上遇到的Ig分子的顯著增加，其據推測伴隨由PEG增 加的分泌。令人驚訝地，如果省略PEG或采用具有較低分子量（〈5000,特別是〈7000,特別 是〈8000)的PEG，則在細胞表面上觀察到不足數目的結合的Ig分子，這可能也解釋與TO 2010/005863的方法的差異。通常，在釀酒酵母上特別是整個Ig分子的分泌和表面呈遞迄 今為止已被證明是復雜的。
[0014] 與來自W0 2010/005863的方法相反，在根據本發明的本方法中，僅蛋白（即細胞 壁蛋白和Fc結合結構域的融合蛋白）的表達已被調節，優選通過GAL1啟動子調節，而IgG 分子，例如VHH-Fc融合蛋白永久表達，也就是組成型表達，無論包含Fc結合結構域的其它 蛋白的表達。
[0015] 根據本發明，凝集素，特別是a_凝集素，被用作細胞壁錨定蛋白。這與其亞單位 agalp直接結合至細胞壁。在酵母細胞中表達且經由二硫鍵結合至agalp的根據本發明的 融合蛋白包含凝集素的第二亞單位，aga2p，其C末端結合至來自蛋白A的ZZ結構域。 [0016] 因此，本發明還提供了相應的方法，其中細胞表面錨定蛋白是a _凝集素或a _凝 集素，且融合蛋白包含aga2p和Fc結合結構域，優選來自金黃色葡萄球菌的蛋白A的ZZ結 構域。
[0017] 因此，本發明特別提供其中ZZ結構域和aga2p的融合蛋白的表達（和分泌）受 GAL1啟動子調節的方法。
[0018] 本發明還特別提供其中抗體、抗體片段或抗體結構域的表達（和分泌）在GAPDH 啟動子的控制下的方法，其中表達組成型發生，用于表達ZZ結構域和aga2p亞單位的融合 蛋白。
[0019] 本發明還提供了相應的方法，其中在表達/分泌中，在表達培養基中采用具有〉 5, 000、特別是> 7, 000 - 8, 000的分子量的PEG，優選PEG8000。
[0020] 最后，本發明提供用于產生用于生成和選擇具有所選表型或結合特性的整個抗 體、Fab片段或其它生物活性抗體結構域的抗體文庫的相應方法。
[0021] 發明詳沐 通常，根據本發明的方法中采用的免疫球蛋白是IgG、IgA、IgE或IgM分子，但優選IgG 分子，其包括 IgGl、IgG2、IgG3 和 IgG4。
[0022] 術語"轉染（transf iz ieren) "、" 轉染（Transf ection) "、" 轉化 (transformieren) "或"轉化（Transformation) "同義使用，并且根據本發明意指將異源核 酸（DNA/RNA)引入進真核細胞，特別是酵母細胞。
[0023] 根據本發明，抗體片段被理解為意指優選的單克隆抗體的功能部分，諸如Fc、Fab、 Fab'、Fv、F(ab'）2、 SCFv。根據本發明，相應的生物活性片段被理解為意指能夠結合抗原的 那些抗體部分，諸如Fab、Fab'、Fv、F (ab'）2和scFv。
[0024] 根據本發明，Fc結合結構域被理解為意指分子或分子的部分，優選蛋白或多肽，其 能夠共價或非共價結合抗體的Fc部分或其區域。根據本發明，Fc結合結構域優選非共價 結合抗體或免疫球蛋白的Fc部分。
[0025] 本申請中呈現的用于酵母細胞上的非共價表面呈遞的方法已經成功地用于 VHH-Fc蛋白和IgG分子的表面呈遞。ZZ結構域和Fc部分之間的非共價相互作用的穩定性 保證足夠穩定的基因型-表型偶聯，并且以這種方式使得能夠將所述方法用于在不同混 合物內富集目標細胞。所述方法的將來用途在于，例如，在蛋白工程領域中篩選IgG分子或 多種Fc融合蛋白的文庫用于鑒定具有期望特性的蛋白。使用已知含有滿足期望的功能要 求的變體的文庫包含在此處是有利的。由于所述方法在表面呈遞過程中可以描繪VHH結構 域的親和力的甚至微小的差異，所以該方法特別適合于抗體的親和力成熟與隨后的可溶性 生產和生物物理表征。
[0026] 為了簡化所述方法，使用可以嘗試使用替代錨定蛋白用于表面呈遞ZZ結構域，因 為作為結果，所述使用不再限于使用酵母菌株EBY100。來自釀酒酵母的許多細胞壁蛋白原 則上適合于表面呈遞異源蛋白。文獻中為此描述了許多實施例 93' "。使用不同的錨定蛋白 使得可能獨立選擇表達菌株，因為不再必須使用具有Agal表達盒的染色體整合的菌株，諸 如EBY100。這額外打開了生成和使用適合于異源蛋白的特定需求的表達菌株的可能性。
[0027] 根據本發明的質粒構建顯示于圖36至39。這些通常只提供質粒和質粒構建的實 例或優選實例，并且可以由本領域技術人員在任何時間替換為其它或其變體，只要采用本 發明必需的相應的DNA序列且啟動期望的功能。
[0028] 此外，以穩定方式將ZZ結構域整合至酵母基因組中以使得可能更靈活選擇標記 用于可溶性分泌和更容易生成分子文庫也可以證明是有利的。為了增加分泌效率，進一步 菌株操作是可建議的，因為氧化還原酶roi的過表達沒有導致期望的蛋白產率。參與分泌 的進一步ER-定位蛋白（諸如，例如，Erolp)的過表達對于實現期望的蛋白產率可能是必 要的。
[0029] 金昔色葡萄球菌蛋白A 在細菌的表面上，尤其發現存在可以以高親和力結合免疫球蛋白的蛋白61。它們在其 就宿主物種和它們可以結合的免疫球蛋白種類而言的特異性方面不同。細菌的主要致病性 代表為葡萄球菌屬和鏈球菌屬。表面蛋白的生物功能包含用蛋白固有的蛋白掩蔽細菌細 胞，以便逃避宿主的免疫系統62。最好的已知免疫球蛋白結合細菌表面蛋白之一是被稱為 SpA的金黃色葡萄球菌蛋白A。其用于生物技術中用于IgG分子和Fc融合蛋白的親和純 化，且由五個結構域構成，所有五個結構域都有助于IgG結合，且也仍單獨具有IgG結合特 性 63。IgG分子的結合主要經由Fc部分發生。此外已經證明了 SpA與Fab片段的結合64。 SpA的結構域結構顯示于圖I65。除了高序列同源性的五個結構域（E、D、A、B和E)以外，還 存在兩個進一步結構域（X和M)(其介導細菌細胞壁中SpA的錨定）和N末端信號肽（SP) (其將SpA導航至細胞壁）。SpA與Fc部分的結合是pH依賴的 61。最強的結合存在于8的 pH66。如已經提到，結構域E、D、A、B和E也可以單獨地介導Fc部分和Fab片段的結合。作 為結果，出現了尤其就這些結構域的生物技術用途而言的優點。由于與SpA相比更小的尺 寸，與SpA相比簡化了單個結構域的重組產生。人工結構域衍生自結構域B且在1987年由 Nilsson和同事通過在位置29的氨基酸取代而生成 67。其就是所謂的Z結構域，并且表現 出增加的化學穩定性。此外，Z結構域與Fab片段的結合的損失通過提到的氨基酸取代實 現。作為結果，Z結構域排他地經由Fc部分結合IgG分子 68。如結構域B，Z結構域還采取 三個a _螺旋的結構69, 7°。通過使用重復的Z序列（ZZ結構域），ZZ結構域與Z結構域相 比實現對于Fc部分的更強的結合。ZZ結構域是二價分子，這意味著由于親合力作用導致的 與單價Z結構域相比加劇了 Fc結合71。
[0030] 酵母細朐h的表而呈涕 酵母細胞的表面上的蛋白和肽文庫的暴露用作蛋白的定向進化的技術，并且在文獻中 被稱為"酵母表面呈遞"。該技術由Boder和Wittrup在1997年建立92。他們首次成功地 在酵母細胞的表面上功能呈遞組合文庫的scFv片段，通過流式細胞術篩選它們，并且分離 對于抗原具有增加親和力的scFv片段 92。基因型和表型的穩定偶聯使其變得可能，因為 scFv片段被呈遞為具有酵母固有的細胞壁蛋白的融合蛋白。據推測，通過使用基于酵母的 呈遞技術實現的最重要成就是熒光激活的細胞分選（FACS)的直接適用性，這在有效篩選 大變體文庫中是決定性的。穩定的基因型-表型偶聯通過異源蛋白與釀酒酵母的外細胞 壁的蛋白的融合來實現。由此實現的蛋白暴露是與抗原相互作用的前提條件。許多不同的 細胞壁蛋白原則上能夠將異源蛋白和肽作為融合伴侶暴露，例如a -凝集素和a-凝集素、 Cwplp和Flolp93,94。所有這些蛋白中，a-凝集素系統尤其變得確立。該系統目前用于從未 免疫、免疫的和合成的抗體文庫選擇抗體。在2003年，Feldhaus和同事證明從在釀酒酵母 的表面上呈遞的未免疫的人變體文庫選擇高親和力的scFv變體 95。也可能通過酵母細胞 上的Fab片段的表面呈遞成功地證明抗體片段的親和力成熟96。下面部分更詳細地解釋了 Boder和Wittrup在1997年建立的用于借助a-凝集素在酵母細胞上表面呈遞的系統。
[0031]a-凝集素系統 凝集素是釀酒酵母的外細胞壁的配對類型特異性粘附蛋白，且介導在這些細胞與 dipolide接合子融合過程中的互補配對類型的單倍體酵母細胞之間的細胞-細胞粘附。該 過程在文獻中被稱為接合。具有配對類型a的酵母細胞表達a-凝集素，且具有配對類型a 的酵母細胞表達a -凝集素97。細胞壁蛋白a-凝集素由亞單位Agalp和Aga2p建立。亞 單位Agalp具有GPI錨定信號，并且通過0-葡聚糖的共價結合介導蛋白固定