用于蛋白質化學修飾的pictet-spengler連接反應的制作方法
【專利說明】用于蛋白質化學修飾的PICTET-SPENGLER連接反應
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 根據35U.S.C. § 119(e)，本申請要求2012年11月16日提交的美國臨時專利申請 61/727, 501的優先權，通過引用將所述申請的全部內容并入本文。
[0003] 關于聯邦政府在所贊助的研宄或開發獲得的發明中的權利的聲明
[0004] 本發明是在美國政府的支持下作出的，由國家衛生研宄所資助，授權編號 GM59907。美國政府在本發明中具有某些權利。
[0005] 發明背景 [0006] 引言
[0007] 用于蛋白質修飾的反應方法學在數十年來一直是一個活躍的研宄領 域。早期的策略集中在原始氨基酸的全面修飾，提供了獲得各種經修飾的產物的途 徑(Glazer AN(1970), "Specific Chemical Modification of Proteins"，Annu. Rev. Biochem. 39 (I) : 101-130)。然而，各種應用要求蛋白質的位點特異性修飾：生 物物理學研宄需要知道連接報道分子的位點（Michalet X、Weiss S、& J^ger M(2006), "Single-Molecule Fluorescence Studies of Protein Folding and Conformational Dynamics"，Chem. Rev. 106 (5) : 1785-1813)，制備蛋白質微陣列和功能 材料需要在特定取向上的固定（Wong LS、Khan F、&Micklefield J(2009), "Selective Covalent Protein ImmobiIization :Strategies and App Iicat ions"，Chem. Rev. 109 (9) : 4025-4053)，以及蛋白質藥物與聚（乙二醇）或細胞毒素分子的綴合，其 中化學修飾的位點影響所得到的生物制品的藥代動力學和治療學性能（Shen B-Q.等 人（2012)， "Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates"，Nat. Biotechnol.30(2):184-189 ;Cho H 等人(2011), "Optimized clinical performance of growth hormone with an expanded genetic code"，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (22):9060-9065)。因此，該 領域近年來開發了用以實現蛋白質的位點特異性修飾的方法，通常涉及引入表現出生 物正交反應性的非原始官能團（Sletten EM&Bertozzi CR(2009)，"Bioorthogonal Chemistry:Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality"，Angew. Chem. Int. Ed. 48(38):6974-6998 ;Stephanopoulos N&Francis MB(2011), "Choosing an effective protein bioconjugation strategy"，Nat. Chem. Biol.7 (12):876-884)〇
[0008] 醛類和酮類是用于位點特異性蛋白質修飾化學操作的流行選擇。它們作為溫和 的親電子試劑的獨特反應性使得能夠進行與α-效應親核試劑如取代的肼和烷氧基胺的 選擇性綴合，分別生成腙和月虧-連接的產物（Jencks WP (1964), "Simple Carbonyl Group Reactions"，Prog. Phys. Org. Chem. 2:63-128)。已經開發了多種化學方法、酶促方法和遺 傳學方法將醛和酮類以位點特異性的方式引入蛋白質。這些方法包括N末端絲氨酸或蘇氨 酸殘基的高碘酸鹽氧化（Geoghegan KF&Stroh JG(1992), "Site-Directed Conjugation of Nonpeptide Groups to Peptides and Proteins Via Periodate-Oxidation of a 2-Amino Alcohol-Application to Modification at N-Terminal Serine", Bioconjugate Chem. 3 (2) : 138-146);用以得到α -酮酰胺或乙二醛肟酰胺的磷酸吡哆醛-介導 的 N 末端轉氨基作用（Gilmore JM、Scheck RA、Esser-Kahn AP、Joshi NS、&Francis MB (2006)，"N-Terminal Protein Modification through a Biomimetic Transamination Reaction"，Angew.Chem. Int. Ed. 45 (32) :5307-5311 ;Scheck RA、Dedeo MT、Iavarone AT、 &Francis MB(2008)，"Optimization of a Biomimetic Transamination Reaction"，J. Am.Chem.Soc.l30 (35):11762-11770;Witus LS.等人（2010)，"Identification of Highly Reactive Sequences For PLP-Mediated Bioconjugation Using a Combinatorial Peptide Library"，J. Am. Chem. Soc. 132 (47) : 16812-16817 ;Witus LS&Francis M(2009), uSite-Specific Protein Bioconjugation via a Pyridoxal 5'-Phosphate-Mediated N-Terminal Transamination Reaction''，Current Protocols in Chemical Biology，（John Wiley&Sons，Inc);為通過表達蛋白質連接生成的蛋白質C-末端 硫醋添加包含酮的小分子（Esser-Kahn AP&Francis MB(2008)，"Protein-Cross-Linked Polymeric Materials through Site-SelectiveBioconjugation^ , Angew. Chem. Int. Ed. 47(20) :3751-3754);通過琥珀終止密碼子抑制進行的包含酮的非天然氨基酸的遺傳 編碼并入（Wang L、Zhang Z、Brock A、&Schultz PG(2003)，"Addition of the keto functional group to the genetic code of Escherichia coli ^ , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(1):56-61 ;Hutchins BM.等人（2011)，"Selective Formation of Covalent Protein Heterodimers with an Unnatural Amino Acid''，Chem. Biol. 18(3) :299-303 ;Kim CH 等人（2012)，"Synthesis of Bispecific Antibodies using Genetically Encoded Unnatural Amino Acids"，J. Am. Chem. Soc. 134(24):9918-9921);指導帶有酸或酮的小分 子的酶促連接反應的肽標簽的遺傳編碼（Rashidian M、Song JM、Pricer RE、&Distefano MD(2012)，"Chemoenzymatic Reversible Immobilization and Labeling of Proteins without Prior Purification^, J. Am. Chem. Soc. 134(20) :8455-8467 ；Chen KHowarth Lin W、&Ting AY(2005)，"Site-specific labeling of cell surface proteins with biophysical probes using biotin ligase"，Nat. Methods 2(2):99-104);以及用于通 過甲酰甘氨酸生成酶（FGE)進行修飾的位點的遺傳編碼，在我們的實驗室開發的"醛標 簽"方法（Carrico IS、Carlson BL、&Bertozzi CR(2007)，"Introducing genetically encoded aldehydes into proteins"，Nat. Chem. Biol. 3 (6) :321-322 ;Wu P.等人 (2009)， uSite_specific chemical modification of recombinant proteins produced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag''，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 106:3000-3005;Hudak JE、Yu HH、&Bertozzi CR(2011)，"Protein Glycoengineering Enabled by the Versatile Synthesis of Aminooxy Glycans and the Genetically Encoded Aldehyde Tag"，J. Am. Chem. Soc. 133(40):16127-16135) ;Hudak JE 等人（2012)，"Synthesis of Heterobifunctional Protein Fusions Using Copper-Free Click Chemistry and the Aldehyde Tag"，Angew. Chem. Int. Ed 51 (17) :4161-4165 ;Shi X.等人（2012)，"Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged proteins for singlemolecule imaging"，Nat. Methods 9 (5):499-503 ;Rabuka D、Rush JS、deHart GW、Wu P、&Bertozzi CR(2012)，"Site-specific chemical protein conjugation using genetically encoded aldehyde tags"，Nat. Protoc. 7(6):1052-1067) 〇
[0009] 用于將反應性羰基引入到蛋白質中的方法的多樣性與已經廣泛用于它們的化學 修飾的反應的有限數目形成鮮明對比。大多數的報道使用了上述的形成腙和肟的反應， 是因為它們的生物正交性、操作的簡單性（即，不需要輔助試劑）、以及在溫和的含水條件 下的良好收率。然而，得到的C = N鍵容易受到水解的影響（Mueller BM、Wrasidlo WA、 &Reisfeld RA(1990), "Antibody conjugates with morpholinodoxorubicin and acid cleavable linkers"，Bioconjugate Chem. I (5): 325-330)，影響了 它們在需要長時間穩 定性的情況中的應用。例如，認為在Mylotarg (a -CD33與細胞毒素卡奇霉素的一種抗 體-藥物綴合物）中腙的不穩定性是導致了使所述藥物退出美國市場的致命原因之一 (Ducry L&Stump B(2009), "Antibody-Drug Conjugates:Linking Cytotoxic Payloads to Monoclonal Antibodies"，Bioconjugate Chem. 21 (I) :5_13)。月虧被稱為對于水解 最穩定的C = N連接，但是它對于在稀釋條件下的水解仍是熱力學不穩定的，通過酸催 化過程而分解（Kalia J&Raines RT(2008)，"Hydrolytic Stability of Hydrazones and Oximes"，Angew. Chem. Int. Ed. 47(39) :7523-7526)。許多研宄人員發現，在理想存 儲條件（低溫、高濃度、和中性或高pH)下的肟綴合物是動力學穩定的，并由此適合于短 期的實驗室研宄（Hudak JE、Yu HH、&Bertozzi CR(2011), "Protein Glycoengineering Enabled by the Versatile Synthesis of Aminooxy Glycans and the Genetically Encoded Aldehyde Tag"，J.Am.Chem.Soc. 133 (40):16127-16135) ;Shi X.等人 (2012), "Quantitative fluorescence labeling of aldehyde-tagged prot