檢測歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特異性引物及相應檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及檢測歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特異性引物及相應試劑盒。
【背景技術】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以妊娠母豬發生早產、流產、死胎、弱仔和木乃伊胎，仔豬和育肥豬 發生呼吸道疾病，生產性能降低，死亡率升高的一種傳染性豬病。
[0003] 盡管目前國內外對PRRSV的病原學、血清分型、診斷做了大量的研宄，但對全世界 豬及相關產品的威脅眾所周知，它造成的經濟損失每年至少為上百億美元。尤其與其它繁 殖與呼吸綜合征在臨床上很難區分，同時在臨床癥狀和病理變化因感染動物的種類、年齡、 病程長短及感染毒株毒力等不同而有所差別，可能缺乏特征病癥，這給豬繁殖與呼吸綜合 征的診斷和防治帶來極大困難。因此，單靠臨床診斷難以定性。
[0004] 快速簡單的實驗室診斷方法是確診豬繁殖與呼吸綜合征唯一有效地途徑。為了確 定豬繁殖與呼吸綜合征是否在某一地區存在，檢測動物血清抗體的方法并非完全可靠，還 必須通過病原學檢測以確診病原的存在，一般檢測方法為生物學實驗、血清型診斷技術和 分子生物學技術等診斷技術，但是這些方法有的敏感性不高、有的特異性不強、有的檢出率 較低，檢測周期太長，并且這些技術普遍費用太高。隨著2006年第一例歐洲型豬繁殖與呼 吸綜合征在我國檢出，建立一種快速診斷并且能夠區別歐洲型和美洲型株豬繁殖與呼吸綜 合征病毒（PRRSV)的多重RT-LAMP試劑盒，完成對PRRS的快速診斷以及對其進行嚴格監控 具有重要意義。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了檢測歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特異性引物及相應試劑盒。 通過使用特異性引物，利用環介導等溫擴增技術（LAMP)擴增歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病 毒基因組上的特定區域，通過檢測特定產物的形成與否，從分子水平對血液中的歐洲型豬 繁殖與呼吸綜合征病毒核酸進行篩查。
[0006] 本發明提供檢測歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的特異性引物，所述特異性引物 包括外側引物和內側引物； 所述外側引物的序列如下： 上游引物為：5'_ GCTGAATGGGACCGAATCG-3'， 下游引物為：5' -ATACGAGCGCTGCGAAAG-3' ； 所述內側引物的序列為： 上游引物為：5'_ GGATATGAGTGGCAACCGGGirnTTTGTCCAGCCAITTTGACTGG -3'， 下游引物為：5'_ TCTCGGCGCTGTGTCCACTATTTTTCGTACACGCTGCTGAGTAC -3'。
[0007] 本發明的第二個目的是提供歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測試劑盒，所述 試劑盒中包含權利要求1所述的特異性引物。
[0008] 本發明的第三個目的是提供歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測試劑盒的使 用方法，提取待檢物RNA，使用權利要求1所述的特異性引物，采用LAMP方法擴增，對擴增產 物進行分析。
[0009] 作為優選的方案，所述LAMP方法擴增的反應程序為：64°C 60min，然后80°C 5 min〇
[0010] 本發明的第四個目的是提供歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測方法，是提取 待檢物RNA，使用權利要求1所述的特異性引物，采用LAMP方法擴增，對擴增產物進行分析： 反應后的產物肉眼可見底部渾濁；或將反應后的產物電泳，染色后，觀察是否有條帶出現； 肉眼可見底部渾濁或有條帶出現則為檢測到豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
[0011] 作為優選的方案，所述LAMP方法擴增的反應程序為：64°C 60min，然后80°C 5 min〇
[0012] 本發明的第五個目的是提供本發明所述的特異性引物在檢測歐洲型豬繁殖與呼 吸綜合征病毒中的應用。
[0013] 本發明從待檢動物的血液或病死動物的組織中提取其全基因組RNA，以RNA為模 板，以特異性的歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征的引物進行多重RT-LAMP，對得到的產物進行電 泳，根據電泳圖譜分析被檢動物是否感染有歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒。
[0014] 本發明較經典的病毒分離、單RT-PCR和血清型分型方法特異性和敏感性高，試驗 快捷，僅需1小時即可以完成實驗；試驗成本極低。本發明可以相當方便地一次性鑒定歐洲 型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的感染，可以及時快捷的對疫病情況及區域、環境做出及時快 捷的反應，以最短的時間做出正確的處理辦法，這對及時撲滅或阻斷傳染病的傳播具有積 極的意義。本發明的方法具有簡便、經濟、快速、靈敏和特異的特點，具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0015] 附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中： 圖1為歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征的LAMP和PCR檢測方法的敏感性比較圖。A圖， RT-LAMP檢測結果。從左至右依次為：M，DNA分子量標準DL-100 ;1-8泳道：2ng、lng、0. 5ng、 0. 25ng、0. 125ng、0. 0625ng、0. 0313ng 和 0. 0156ng ;B 圖，RT-PCR 檢測結果。從左至右依次 為：Ml，DNA 分子量標準 DL-2000 ;1-8 泳道：2ng、lng、0.5ng、0.25ng、0. 125ng、0.0625ng 和 0· 0313ng ; 圖2為歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征的LAMP與其余病毒的交叉性檢測電泳結果。從左 至右依次為：從左至右依次為泳道，DNA分子量標準DL-2000 ;2泳道，歐洲型豬繁殖與呼 吸綜合征病毒的RNA ;3泳道，豬細小病毒的RNA ;4泳道，豬圓環-2型病毒的RNA ;5泳道， 美洲型PRRSV對照，6泳道，陰性對照血清RNA。
【具體實施方式】
[0016] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0017] 實施例1本發明的歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征檢測試劑盒的使用方法 1歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征的核酸提取 采集待檢動物的血液或病死動物的組織，按照寶生物工程（大連）有限公司提供的 MiniBEST病毒RNA/DNA提取試劑盒提取全病毒RNA。
[0018] 2歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的LAMP反應 參照Genbank登錄的歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的0RF-5基因的序列，本申請人 設計并合成兩對引物。
[0019] 外側引物序列如下： 上游為 F3:5' - GCTGAATGGGACCGAATCG-3' ； 下游為 B3: 5' -ATACGAGCGCTGCGAAAG-3'。
[0020] 內側引物： FIP:5'_ GGATATGAGTGGCAACCGGGTTTTTTTGTCCAGCCATTTTGACTGG -3'； BIP:5'_ TCTCGGCGCTGTGTCCACTATTTTTCGTACACGCTGCTGAGTAC -3'。
[0021] 以提取的歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的RNA為模板，在50 μ L反應體系中 加入歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒RNA 1 μ L，10 μ mol/L的外側上下游引物各1 μ L， lymol/L的內側上下游引物各lyL，2. 5mmol/L的dNTP 2yL，Bst DNA聚合酶8U，10X緩 沖液5以1^，加(1(1!120至終體積為5(^匕1^1^反