鑒別氣溶膠中布魯氏菌s2疫苗株的引物、探針以及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種鑒別氣溶膠中布魯氏菌S2疫苗株的引 物、探針以及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 布魯氏菌病（Brucellosis)是由布魯氏菌屬細菌（牛種、羊種、豬種和犬種布 魯氏菌等）引起的人畜共患傳染病，也是我國法定檢疫和凈化的重要病原。近年來發病 率呈現逐年上升趨勢，尤其是對奶畜危害極大，流產率高達50% -80%，乳、肉產量減少 10% -20%。據《獸醫公報》統計，2013年全國共發生布魯氏菌病3620次，42720頭牛羊發 病。因此，布魯氏菌病給社會經濟發展與穩定、國家公共衛生安全等構成嚴重威脅。
[0003] 布魯氏菌病的傳染源主要是患病動物及帶菌者，它們通過分泌物、乳汁和體液等 將布魯氏菌排出體外，污染環境，同時布魯氏菌粘附在空氣中的灰塵懸浮粒子上，形成氣溶 膠進而傳播，感染其他動物和人。養殖場環境中的布魯氏菌氣溶膠的分布可造成布病的傳 染與流行，給畜牧業生產和人類健康帶來嚴重危害，尤其是當前集約化、高密度養殖環境下 更容易形成布魯氏菌氣溶膠性的流行。因此，通過監測養殖場環境中布魯氏菌氣溶膠，可以 有效地預警預報布病的暴發與流行。
[0004] 我國動物布病防控的主要策略是檢疫與凈化。目前我國牛、羊免疫常用的豬種布 魯氏菌S2弱毒疫苗株在抗原與抗體的診斷上會對布病病毒感染造成干擾。這是因為我國 目前使用的布魯氏菌病診斷方法不能對自然感染和人工疫苗免疫進行鑒別診斷，必然導致 一些自然感染的病畜逃避檢疫，使患病動物長期存在，對牛羊和人類的安全長期構成威脅， 因此，我國很難實行布病的檢疫、撲殺、凈化的防控規程。
[0005] 以布魯氏菌S2疫苗株與其他布魯氏菌基因組差異DNA序列為鑒別靶序列，應用 RPA-LFD技術，可以實現布魯氏菌S2疫苗株與其他布魯氏菌毒株現場快速鑒別診斷。RPA技 術通過三種酶的混合物，即能結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白 (SSB)和鏈置換DNA聚合酶，在常溫下也有活性，最佳反應溫度在38°C左右，整個過程一般 可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。RPA檢測的靈敏度很高，能夠將痕量級（trace levels)的核酸（尤其是DNA)模板擴增到可以檢出的水平，從單個模板分子得到大約IO 12 擴增產物，更適合低濃度的臨床檢測模板。而且RPA還用不著復雜的樣品處理，適用于無法 提取核酸的實地檢測。目前，RPA反應可以通過瓊脂糖凝膠電泳，熒光擴增曲線和LFD試紙 條三種不同方式檢測結果，這三種方式的引物與探針的反應原理是不同的。凝膠電泳和熒 光擴增曲線法仍然依賴實驗室和特殊儀器設備，而LFD是一種無需特殊儀器可用于現場的 方法。
[0006] RPA-nfo反應的引物與探針的設計目前沒有具體的規則，只能經過RPA反應后 應用側流層析試紙條（LFD)檢測，才能篩選獲得可用于臨床檢測的引物與探針組合。在 RPA-nfo正反向引物的擴增靶序列中設計一條帶FAM標記的特異探針，同時反向引物用生 物素標記，生物素標記的RPA產物與FAM標記的特異探針雜交、FAM標記的特異探針與抗 FAM抗體的金標物結合后，將該免疫復合物滴加到試紙條上，免疫復合物通過層析膜擴散， 擴散到檢測線時，生物素標記的擴增產物被生物素配體捕獲，形成具有顏色的檢測線，即檢 測條帶。不被捕獲的免疫復合物繼續擴散到質控線被特異性抗體所捕獲，形成具有顏色的 質控線，即對照條帶。這樣RPA技術與側流層析技術結合，即RPA-LFD技術，可以通過側流 層析試紙條（LFD)讀取結果，本方法既不要求特殊儀器設備，也無需復雜的樣品處理，僅僅 使用普通的加熱裝置如水浴鍋和側流層析試紙條就可以通過肉眼觀察結果。因此，RPA-LFD 技術在布魯氏菌氣溶膠等臨床樣本的現場診斷以及疫苗株S2的鑒別方面具有廣闊的應用 前景。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種快速鑒別氣溶膠樣本中布魯氏菌S2疫苗株的引物、探 針以及試劑盒。
[0008] 為實現以上目的，本發明的技術方案為：
[0009] 一種鑒別氣溶膠中布魯氏菌S2疫苗株的引物和探針，其中，Brucella-RPA-LFD正 向引物序列如SEQIDNo. 1所示，反向引物序列如SEQIDNo. 2所示，探針序列如SEQIDNo. 3所 示；S2-RPA-LFD正向引物序列如SEQIDNo. 4所示，反向引物序列如SEQIDNo. 5所示，探針序 列如SEQIDNo. 6所示。
[0010] 一種鑒別氣溶膠中布魯氏菌S2疫苗株的試劑盒，所述試劑盒包括上述引物和探 針。
[0011] 優選的，所述試劑盒還包括大腸桿菌來源的recA重組酶、鏈置換DNA聚合酶、單鏈 DNA結合蛋白（SSB)、rehydration緩沖液、280mM醋酸鎂（MgAc)溶液、側流層析試紙條（特 異性檢測生物素與FAM標記基因擴增產物）、PBST試紙條檢測緩沖液（1XPBS+0. 1 %吐溫 20)、滅菌去離子雙蒸水（ddH20)，TE緩沖液、10%(W/ V)SDS、2%(W/V)蛋白酶K和布魯氏菌 S2疫苗株標準陽性模板。
[0012] 一種鑒別氣溶膠中布魯氏菌S2疫苗株的方法，包括如下步驟：
[0013] (1)提取檢測樣本中的DNA ;
[0014] (2)以步驟⑴中得到的DNA為模板，進行RPA擴增；
[0015] (3)檢測RPA擴增的產物，判定樣本中是否含有布魯氏菌S2疫苗株。
[0016] 優選的，步驟（1)中，提取檢測樣本中的DNA是通過對檢測樣本進行裂解處理得到 的。
[0017] 優選的，步驟（2)中，所述RPA擴增體系的體積為50yL，包括ΙΟμΜ的上游引物 2. 1 μ L、10 μ M 的下游引物 2. 1 μ L、10 μ M 的探針 0· 6 μ L、rehydration 緩沖液 29. 5 μ L、待 測樣本DNA或粗裂解產物和CldH2O 13. 2 μ L以及280mM醋酸鎂溶液2. 5 μ L。
[0018] 進一步優選的，步驟（2)中，所述醋酸鎂溶液是在其他各個組分在TwistAmp nfo 反應管中混合均勻以后加入的。
[0019] 優選的，步驟（2)中，RPA擴增的溫度為38°C，擴增時間為20min。
[0020] 優選的，步驟（3)中，RPA擴增產物的檢測方法為：
[0021] 將2 μ L RPA擴增產物與98 μ L LFD試紙用的緩沖液的混合溶液，浸泡LFD試紙 5min后，觀察結果。
[0022] 進一步優選的，步驟（3)中，樣本中是否含有布魯氏菌S2疫苗株的判定方法為：
[0023] 若Brucella-RPA-LFD與S2-RPA-LFD兩個檢測組合同時出現檢測條帶和對照條 帶，則該樣本中布魯氏菌S2疫苗株感染陽性；
[0024] Brucella-RPA-LFD檢測組出現檢測條帶和對照條帶，而S2-RPA-LFD檢測組僅出 現對照條帶，則說明該樣本中含有布魯氏菌S2疫苗株以外的其他布魯氏菌；
[0025] Brucella-RPA-LFD與S2-RPA-LFD兩個檢測組均未出現檢測條帶而出現對照條 帶，則說明檢測樣本中不含有布魯氏菌屬細菌；
[0026] 出現其他情況則說明RPA-LFD布魯氏菌S2鑒別檢測不成立。
[0027] 與現有技術相比，本發明的優點在于：
[0028] (1)本發明提供的布魯氏菌屬細菌與S2疫苗株鑒別診斷的RPA-LFD引物與探針組 合或試劑盒靈敏性高、特異性強，最低均可以檢測到2. 5 X IOtlCfu的布魯氏菌屬細菌或布魯 氏菌S2疫苗株細菌。
[0029] (2)Brucella-RPA-LFD檢測組與大腸桿菌0157:H7、小腸結腸炎耶爾森菌0:9、沙 門氏菌以及金黃色葡萄球菌等均無交叉反應；S2-RPA-LFD檢測組與其他布魯氏菌株以及 大腸桿菌〇157:H7、小腸結腸炎耶爾森菌0:9、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌等均無交叉反 應。
[0030] (3)本發明提供的布魯氏菌S2疫苗株鑒別診斷RPA-LFD引物與探針組合或試劑盒 不僅僅可用于布魯氏菌S2疫苗株菌株與氣溶膠樣本的檢測，還可用于其他臨床樣本如血 液和奶樣等的檢測。
[0031] (4)本發明提供的布魯氏菌S2疫苗株鑒別診斷RPA-LFD檢測方法使用方便，無需 特殊儀器設備，僅僅在38°C下，20min就能對待測樣本的粗裂解物進行布魯氏菌S2疫苗株 的靈敏、特異、簡易地鑒別檢測，適合現場或基層布病S2疫苗株與野毒株的鑒別診斷工作， 也可用于布魯氏菌屬細菌的檢測。
【附圖說明】
[0032] 圖1為布魯氏菌S2疫苗株鑒別診斷RPA-LFD檢測組合的引物與探針的篩選結果， 其中，Control Primer/Probe Mix擴增組為TwistAmp nfo kit提供的引物、探針與模板的 RPA擴增結果；Brucella-RPA-LFD組為本發明篩選出的特異性檢測布魯氏菌屬細菌的引物 與探針的擴增結果；S2-RPA-LFD組為本發明篩選出的特異性檢測布魯氏菌S2疫苗株的引 物與探針的擴增結果；NC是以CldH 2O代替模板的陰性對照。
[0033] 圖2布魯氏菌S2疫苗株鑒別診斷RPA-LFD靈敏性檢測結果，其中，模板分別為 2. 5 X IO6Cfu - 2. 5 X KT1Cfu豬種布魯氏菌S2疫苗株基因組DNA，NC是以CldH2O代替模板的 陰性對照組。
[0034] 圖3布魯氏菌S2疫苗株鑒別診斷RPA-LFD特異性檢測結果，其中，B. suis S2、B.ab