檢測ApoE基因多態性的引物、試劑盒及其PCR方法

檢測ApoE基因多態性的引物、試劑盒及其PCR方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學基因檢測領域，特別提供了檢測ApoE基因多態性的引物、 試劑盒及其PCR方法，用于ApoE基因 rs429358和rs7412兩個多態位點的快速檢測。
【背景技術】
[0002] ApoE基因與多種心腦血管疾病密切相關，其編碼的載脂蛋白E (Apolipoprotein E，ApoE)參與高血脂癥、動脈粥樣硬化、冠心病等心腦血管疾病的整個發生發展過程，ApoE 基因多態性是這些疾病早期及發展過程中個體差異的主要原因。
[0003] ApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸（Arg)和半胱 氨酸（Cys)的交換決定了異構體的種類。ApoE基因有3種異構體，分別為ApoE2、ApoE3 和ApoE4,其中ApoE3在中國人群中分布比較廣泛，所占比例約為60%~70%，也可稱為正常基 因。每一個等位基因對應于一個主要異構體產生三種純合子（E2/E2, E3/E3, E4/E4)和三 種雜合子（E2/E3，E2/E4，E3/E4)共六種常見表型。ApoE基因具有異構體特異性，即不同基 因編碼的蛋白質功能具有差異性，從而導致不同蛋白質對脂質的代謝能力不同、抗氧化及 抗炎癥能力不同。
[0004] ApoE基因多態性是冠心病（CHD)早期及發展過程中個體差異的主要原因，通過 ApoE基因多態性的檢測可以了解個體CHD及心肌梗塞（MI)的易感性。Ap〇E2的作用是降 低膽固醇濃度，對冠狀動脈硬化的發展有一定的防護作用，而ApoE 4則會使血漿LDL-C、TC 濃度升高，易誘發CHD及MI。
[0005] 另外國內外多項研宄發現，ApoE基因是目前已知的阿爾茨海默病最密切的遺傳標 志物，Ap 〇E4攜帶者阿爾茨海默病的易感性增加。
[0006] 目前對基因突變和基因多態性的檢測，常見有直接測序法；基因芯片雜交法； PCR-RFLP方法；PCR擴增產物毛細管電泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲線分析技 術；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探針法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。這些方 法或多或少還存在儀器價格高，操作難度大，存在一定假陰性和假陽性，檢測成本高，臨床 普及程度低，不能同時大規模檢測臨床標本等缺點。
[0007] 如：1)直接測序法是突變分析的金標準，能發現已知和未知突變位點，但該法檢測 基因突變的靈敏度為20%(即目的基因的突變基因 DNA模板數占野生型DNA模板數的20%)。 同時還存在操作復雜，周期長，分析速度慢，常需要2天的時間，而且該法是開管操作，大大 增加污染的可能性，不適合對大規模標本的檢測，同時還需要昂貴的儀器，存在在基層不易 實施等缺點。
[0008] 2)普通PCR-RFLP方法技術簡便，價格便宜，適宜少量樣本的實驗室檢測，但RFLP 僅能檢測有酶切位點的突變，無酶切位點不能檢測，費時費力，還存在PCR產物污染導致 假陽性的風險，見[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3) :163-9, United States Patent 20120135406]。
[0009] 3)芯片技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化等特點，適用 于全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴。
[0010] 4) PCR高分辨熔解曲線分析技術，能高通量檢測基因的突變情況，試劑成本較低， 但因其熒光信號來自染料，特異性受到影響，而且檢測儀器是升級版的熒光PCR儀，價格高 昂，普及受限，見[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0011] 5) PCR-Taqman MGB探針法適合已知突變位點，常常需要兩條探針，而Taqman MGB探針的合成價格是普通Taqman探針的幾倍，見[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8) :2909-15 ;United States Patent 20090311679]，并且不能檢測樣本中的含量 較少（彡1，〇〇〇個中的1個）的等位基因或突變位點。
[0012] 6)PCR_SSCP法雖然簡單，但該法是開放性的檢測系統，容易造成PCR產物的污染， 而且操作步驟多，費時費力。
[0013] 7)等位基因特異性引物PCR擴增法（AS-PCR)，這一方法是目前檢測基因突變或 SNP最簡單快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B·，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端堿基與模板的堿基錯配，其PCR的 效率將會下降 IO3-IO6.6倍（Chen, X·，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。盡管該方法的原理簡單，但錯配的引物，依然會發生非特異 性擴增，擴增情況視突變的類型和檢測位點周圍的堿基序列相關（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J·, Anal Biochem 2000; 284:11-18)，還與樣本中存在的等位 基因變量的影響。為了增加 AS-PCR的特異性，許多科學家做了很多努力。大量的實驗證 明，該方法最關鍵的是設計與3'末端突變位點堿基互補或錯配的兩條特異引物，引物設 計不好，將導致高背景的交叉擴增，會導致較高的假陽性。盡管不少人努力將這一弊端克 月艮，如報道的TaqMAMA方法，在3'倒數第二位或第三位上引入突變堿基，的確可以增加 反應的特異性，但仍然無法完全消除假陽性，而且在純合子與雜合子的判斷上，缺乏標準， 會出現混亂的情況，見[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb; 83 (2) :311-20]。簡單的AS-PCR，通常采用PCR反應結束后再進行電泳，從有無反應 條帶來判斷結果，這種方法雖然不需要昂貴的儀器，但電泳操作，增加了 PCR的污染機會， 而且耗時費力。盡管有人對該方法作了改進，采用熒光定量PCR技術，但得到的不是"全或 無"式的結果，總會有非特異性反應的發生，即同樣的引物對野生型和突變型位點都會擴 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突變Ct，但計算復雜，如要Λ Ct值大于純合子Ct值判為突變型純合子，Λ Ct值 小于雜合子Ct值，判為雜合子，ACt值的引入不僅增加了操作步驟，還會引起混亂，因為 ACt值的設定標準無法準確定位，不同人員的操作、不同的標本和不同的檢測儀器都會有 不同的數字，給臨床應用帶來很大的困難，實際應用依然受限，見[中國專利CN101235415， CN101565742A]〇
[0014] 8)美國LIFE公司采用一種MGB封閉探針的方法，稱作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探針將不檢測的位點封閉，然后用等位基因特異 引物熒光定量PCR的方法檢測目的位點，這雖然提高了檢測的特異性，但由于多加入一 條MGB封閉探針，勢必增加成本，對反應效率多少會帶來干擾，見[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3) :275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用鎖 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修飾的堿基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR檢測靈敏度提高。然而，這些方法增加了分析的總體成本，并 需對反應進行深度優化。
[0015] 目前，國內已上市有注冊證的ApoE基因檢測試劑盒有如下幾種：1、廣州科方生物 技術有限公司的"載脂蛋白E (ApoE)測定試劑盒（免疫比濁法）"，粵食藥監械（準）字2014 第2400852號；2、北京利德曼生化股份有限公司的"載脂蛋白E測定試劑盒-ΑΡ0Ε(免疫比 濁法）"京食藥監械（準）字2012第2400826號；3、北京恩濟和生物科技有限公司的"載 脂蛋白E(ApoE)測定試劑盒（免疫比濁法）"，京食藥監械（準）字2013第2401277號；4、 長春匯力生物技術有限公司的"載脂蛋白E(ApoE)測定試劑盒（免疫比濁法）"，吉食藥監 械（準）字2014第2400070號等共9種產品，均是免疫學方法。
[0016] 免疫比濁法是抗原抗體結合動態測定方法，通過測定反應液的濁度與一系列標準 品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量。操作過程受很多因素的限制，如抗原或抗體量太大 過剩，可出現可溶性復合物，造成誤差；必須維持反應管中抗體蛋白始終過剩；易受到脂血 的影響。免疫比濁法分為三類：免疫透射比濁法；免疫散射比濁法和免疫膠乳比濁法。對實 驗操作條件均有較多的要求，且結果判斷繁瑣。
[0017] 目前從基因水平檢測ApoE多態性的方法大致有以下幾種，反向斑點雜交、基因芯 片、Taqman-MGB雙探針法及直接測序等方法。中國專利CNl786188A報道了用反向斑點雜交 方法檢測ApoE基因型的方法，該法存在操作復雜，周期長，以及分析速度慢，容易發生PCR 產物的污染出現假陽性等缺點。中國專利CN 102010897 A公開了一種用液相基因芯片檢測 ApoE多態性的方法，芯片技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化等特 點，適用于全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴，同樣 也存在操作復雜，周期長，以及分析速度慢，容易發生PCR產物的污染出現假陽性等缺點。 中國專利CN101608229A公開了一種用Taqman-MGB雙探針熒光PCR的方法，檢測ApoE基因 型，該法常常需要兩條探針，而Taqman MGB探針的合成價格是普通Taqman探針的幾倍，見 [J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8):2909-15 ；United States Patent 20090311679], 并且不能檢測樣本中的含量較少（多1，〇〇〇個中的I個）的等位基因或突變位點。中國專 利CN 102676669 A采用焦磷酸測序法檢測ApoE基因多態性，直接測序法是目前鑒定基因 型別的金標準方法，能發現已知和未知突變位點，但該方法需要昂貴的儀器，每個位點均需 PCR擴增，然后測序，操作復雜，成本較高、工作量大、周期長、在基層不易實行。
[0018] 因此，如何解決檢測ApoE基因多態性存在的問題，成為人們亟待解決的問題。

【發明內容】

[0019] 鑒于此，本發明提供了一種檢測ApoE基因多態性的引物、試劑盒及其PCR方法， 以至少解決以往試劑盒存在的結果判讀復雜、檢測儀器價格高，操作難度大，存在一定假陰 性和假陽性，檢測成本高，臨床普及程度低，不能同時大規模檢測臨床標本等一個或多個問 題。
[0020] 本發明提供的方案具體為：一種檢測ApoE基因多態性的引物，其特征在于，所述 引物包括分別檢測rs42