一種基于定位探針介導剪切的核酸等溫擴增方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種基于定位探針介導剪切的核酸等 溫擴增方法。
【背景技術】
[0002] 核酸體外擴增技術是目前臨床化學中發展最為迅速的技術領域之一。對核酸的擴 增檢測無論在操作上還是時效上均比其他檢測技術更為實用，因此頗受研宄者和儀器開發 商的青睞。聚合酶鏈式反應（PCR)作為核酸擴增的革命性技術經過三十多年的發展已牢牢 占據領導地位，并涌現多種衍生技術如逆轉錄PCR(RT-PCR)、實時PCR(Real-time PCR)、多 重PCR(Multiplex PCR)、巢式PCR(Nested PCR)等。然而，這些技術嚴重依賴于溫度循環來 實現核酸鏈的變性、退火和延伸三步驟，均屬于變溫核酸擴增技術。
[0003] 近年來，等溫核酸擴增技術已悄然興起，并得以迅猛發展，不僅豐富了核酸擴增 技術的內容，還代表著核酸擴增技術發展的新趨勢。目前，等溫核酸擴增技術有基于核酸 序列擴增技術（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、RNA 的信號介 導擴增技術（Signal mediated amplification of RNA technology，SMART)、鏈置換擴 增技術（Strand displacement amplification，SDA)、滾環擴增技術（Rolling circle amplification，RCA)、環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、單引物等溫擴增技術（Single primer isothermal amplification，SPIA)、解旋 酶依賴型擴增技術（Helicase-dependent amplification，HDA)和基因組指數擴增反應 (Genome exponential amplification reaction，GEAR)等。這些等溫擴增技術能在較短 的時間內實現目標核酸序列的指數擴增，且無需特定的溫度循環，比變溫擴增技術具備更 強的現場和床旁檢測應用潛能。
[0004] 然而，盡管這些技術均有其十分獨特的優勢，但同時也存在各自的局限。為了實現 目標核酸序列以及新生成的反義序列的循環利用，常常需要復雜的引物設計，例如LAMP需 要針對目標核酸序列的6個區域設計至少4條引物，這不僅要依賴于專業的設計軟件，還要 求設計者具有豐富的經驗。SDA等雖然具有相對簡單的反應機理，但由于內切酶對于目標核 酸中特定識別序列的依賴，其通用性受到了很大挑戰。為了在目標核酸中引入內切酶的識 別序列，也不得不訴諸于復雜的引物設計，這不僅大大增加了非特異性擴增的嚴重程度，同 時加大了擴增失敗的風險。另一方面，這些技術幾乎都是從引物的延伸來啟動擴增反應的， 即首先由引物（含特定堿基序列的寡核苷酸鏈）來識別目標核酸序列，并在聚合酶作用下 沿目標核酸序列延伸，緊接著該延伸產物從目標核酸序列脫離以實現循環擴增。采用這種 方式來啟動擴增反應的主要缺點在于缺乏有效的手段來抑制非特異性擴增反應，這是目前 絕大多數等溫指數擴增方法尚未解決的難題。因此，亟需進一步發展更加簡單、通用、高靈 敏、高特異性的核酸等溫指數擴增方法。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了一種基于定位探針介導剪切的核酸等溫擴增方法，該方法不僅能夠 克服內切酶對目標核酸序列中特定識別序列的依賴，解決目標核酸序列任意剪切繼而引發 擴增反應的難題，還能降低引物設計的難度，同時提高方法的通用性、靈敏度與特異性。
[0006] -種核酸等溫擴增方法，包括酶切目標核酸序列、指數擴增反應，酶切目標核酸序 列所采用的試劑包括上、下游的定位探針和內切酶，所述定位探針包括一段雙鏈以及至少 一段與雙鏈相連接的單鏈，所述單鏈具有可與目標核酸序列特異性雜交的識別區，所述雙 鏈具有鄰近識別區的供內切酶結合的結合區。
[0007] 上述方法中內切酶與所述的定位探針的雙鏈結合區進行結合，并通過單鏈的識別 區與目標核酸序列進行雜交被定位到目標核酸序列的指定區域內，從而完成對目標核酸序 列的精確剪切。
[0008] 上述核酸等溫擴增方法是在現有鏈置換擴增技術（Strand displacement amplification，SDA)的基礎上做的重要改進，該方法的整個反應體系中，主要包括以下組 分：目標核酸序列，具有鏈置換活性的核苷酸聚合酶（簡稱聚合酶），上、下游引物，上、下游 定位探針，內切酶，反應緩沖液，dNTPs和鎂離子；其中，上、下游引物至少包含3'端的保護 結構（即：終止劑或垂懸序列），可與目標核酸序列特異性雜交的目標核酸識別序列，可供 內切酶結合的內切酶識別序列。
[0009] 該方法的具體反應原理，如下：
[0010] a)反應體系中，上游定位探針與目標核酸序列的上游序列（位于目標核酸序列的 3'端）特異性結合后，內切酶與上游定位探針的雙鏈結合區結合，并對目標核酸上游序列 的特定位點進行剪切；
[0011] b)被剪切后的目標核酸序列與上游定位探針分離，轉而與上游引物結合，并在聚 合酶的作用下，以上游引物為模板，沿上游引物的5'端進行延伸，延伸的核酸序列與上游引 物序列形成雙鏈的內切酶識別區域；
[0012] c)內切酶與b)中形成的雙鏈的內切酶識別序列結合，并對上游引物上的內切酶 剪切位點進行剪切，形成切口；接著，聚合酶以該切口為起始點，以目標核酸序列為模板， 沿目標核酸序列的5'端進行延伸，不僅置換掉原有的部分引物序列，而且延伸獲得目標核 酸序列的反義序列（該反義序列僅包含目標核酸序列5'末端到內切酶剪切位點之間的互 補序列）；然后，內切酶再次剪切上述上游引物的內切酶剪切位點，形成切口，在聚合酶的 作用下進行引物延伸、置換掉所述的反義序列，形成新的反義序列，通過上述過程的不斷重 復，反應體系中，形成了大量的目標核酸序列的反義序列；
[0013] d)再以上述反義序列為目標核酸序列，下游定位探針會與反義序列（位于反義序 列的3'端）特異性結合，然后，內切酶與下游定位探針的雙鏈結合區結合，并對反義序列的 特定位點進行剪切；
[0014] e)被剪切后的反義序列與下游定位探針分離，轉而與下游引物結合，并在聚合酶 的作用下，以下游引物為模板，沿下游引物的5'端進行延伸，延伸的核酸序列與下游引物序 列形成雙鏈的內切酶識別序列；
[0015] f)內切酶與e)中形成的雙鏈的內切酶識別序列結合，并對下游引物上的內切酶 剪切位點進行剪切，形成切口；接著，聚合酶以該切口為起始點，以反義序列為模板，沿反義 序列的5'端進行延伸，不僅置換掉原有的部分引物序列，而且延伸獲得目標核酸序列的同 義序列（該同義序列僅包含目標核酸序列5'端和3'端剪切后剩余的序列）；然后，內切酶 再次剪切上述下游引物的內切酶剪切位點，形成切口，在聚合酶的作用下進行引物延伸、置 換掉所述的同義序列，形成新的同義序列，通過上述過程的不斷重復，反應體系中，形成了 大量的目標核酸序列的同義序列；
[0016] g)通過上述過程，可以獲得大量的目標核酸序列的待擴增部分序列（即f)中的同 義序列），然后，再通過上、下游引物進行指數擴增，即：上述同義序列與上游引物結合，并 以上游引物為模板進行延伸，形成雙鏈內切酶識別序列；上游引物被剪切后，以該同義序列 為模板進行延伸，獲得該同義序列的反義序列，不斷重復此過程可以生成越來越多的該反 義序列。同理，該反義序列與下游引物又可以繼續生成上述的同義序列，最終實現從目標核 酸序列中待擴增部分序列的指數擴增。
[0017] 核酸定位探針的結合區只是核酸定位探針雙鏈中的一部分區域，結合區的兩端還 可以有非內切酶識別序列；同樣，上述識別區也只是核酸定位探針單鏈的一部分區域，識別 區的兩端還可以有非目標核酸識別序列；但是，結合區與識別區必須相互靠近，以確保內切 酶能夠剪切到目標核酸序列，結合區與識別區之間可允許間隔的堿基對數（單鏈區按核苷 酸數計）根據內切酶的類型來確定。
[0018] 本發明所述的"靠近"是指結合區與識別區不宜間隔過大，以避免內切酶無法剪切 目標核酸序列，結合區與識別區相互間隔的核苷酸數應根據具體內切酶識別序列與剪切位 點間的核苷酸數量來確定。
[0019] 作為優選，所述核酸定位探針包含兩段含識別區的單鏈，兩段單鏈連接于雙鏈的 同一端，或者所述核酸定位探針包括單鏈環，所述單鏈環和單鏈分別連接于雙鏈的兩端。
[0020] 更優選的是，所述核酸定位探針不僅包含兩段含識別區的單鏈，兩段單鏈連接于 雙鏈的同一端，而且還包括單鏈環，所述單鏈環和單鏈分別連接于雙鏈的兩端。
[0021] 進一步地，所述單鏈環的核苷酸數量大于等于0,小于等于50。
[0022] 理論上，本發明所述的核酸定位探針只需具有結合區和識別區即可實現核酸剪 切，針對上述結構區域，本發明提供了多種可行的核酸定位探針結構，具體如下：
[0023] 所述核酸定位探針由單條核苷酸鏈分子內互補雜交形成或由兩條核苷酸鏈部分 互補雜交形成。
[0024] 若以兩條核苷酸鏈形式存在，該核