用于檢測玉米Proline1基因的引物組及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于檢測玉米/￥07i/^7基因的引物組及其應用。
技術背景
[0002]玉米(Zea mays)是世界上分布最廣的糧食作物之一，栽培面積僅次于小麥和水稻，位居世界第三位。它是全世界同時也是我國主要的糧食和飼料作物。此外，在發達國家，玉米還被廣泛的應用于工業原料的生產。據FAO統計，從1998年起，玉米總產量已超過小麥和水稻成為世界第一大糧食作物。在我國，從1995年開始，玉米總產量已超過小麥，成為國內僅次于水稻的第二大糧食作物。作為食品、飼料和燃料的重要來源，玉米的全球需求和消耗正在急劇增加。特別是，新興國家飲食結構的調整:肉類消費不斷增加；以及發達國家利用糧食生產生物燃料的加速。這使得糧食問題日益凸現，已成為制約世界經濟發展及安全的關鍵因素之一。因此，只有通過不斷提高農作物的產量，在世界有限的耕地上生產出更多的糧食，才能滿足社會需求，維持世界安全和全球經濟可持續發展。為保證國家糧食安全，我國提出了構建糧食核心區、到2020年再增產糧食1000億斤的戰略目標，其中需要新增玉米400億斤(全國新增1000億斤糧食生產能力規劃2009-2020年，2009，國務院)。因此，這對玉米產量和品質的改良與創新提出了更高的要求。
[0003]從產量決定的角度來看，玉米是C4作物。C4植物的理論光合轉化效率為6%，要顯著高于C3植物的4.6%的水平。因此，玉米本身具有十分優異的光合效率或“源”能力(Source Capacity)因此玉米已經成為研宄生物產量和質量相關機制生物質能源的模式系統。除了產量，玉米的主要生產性狀還表現在營養價值這一方面。研宄表明，玉米籽粒的主要成份為淀粉，蛋白質和油脂，而蛋白對玉米營養價值的影響是至關重要的。一般來講，玉米籽粒中的儲藏蛋白(主要是醇溶蛋白，占70%)由于氨基酸種類上的偏好性，造成了一些必需氨基酸的匱乏，尤其是賴氨酸的缺乏，它僅含有1.5-2%的賴氨酸，而最佳的人類營養比例是5%，因此在很大程度上限制了玉米的營養價值及應用廣度。而大多數粉質胚乳突變體都有一個共同的特征:賴氨酸的含量顯著增加，從而改良了蛋白品質。其中，以opaque2的突變尤為顯著，賴氨酸含量增加接近2倍。研宄表明，大多數此類突變體蛋白品質的改善得益于非醇溶蛋白與醇溶蛋白的比例的增加。
[0004]為了提高玉米品質和營養價值，從上個世紀開始，越來越多的國內外科研人員就開始利用生物學的方法對玉米的品質進行改造。優質蛋白玉米(Quality Protein MaizeQPM)便在這樣的情況下產生了。其基本原理是:以玉米中一些籽粒的突變體為材料，借助于遺傳學的研宄手法對其進行改造，提高其營養價值。在玉米中，有一類與蛋白品質相關的突變體，被稱為高賴氨酸突變體。在表型上，這類突變體一般具有不透明或粉質的籽粒，在玉米遺傳上被稱為Opaque或Floury突變體。生化方面，這類突變體能夠顯著提高玉米籽粒中賴氨酸等必需氨基酸的含量，進而提高玉米的營養價值。其中最為有名的是0paqUe2
(02)突變體和floury-2(fl2)突變體，這是兩類能夠顯著改變胚乳儲藏蛋白氨基酸含量的突變類型。02和fl2已經被克隆，它們影響了玉米胚乳中22kDa α醇溶蛋白的合成和積累，從而改變了蛋白質中氨基酸的含量與成分，使得賴氨酸含量有顯著的提高。目前，02已被世界各國廣泛用來培育優質蛋白玉米品種，為玉米育種作出了極大貢獻。
[0005](簡稱/^07)也是一個類似的高賴氨酸突變體。對prol突變體的遺傳學分析表明:/^07是單基因控制的隱性突變，能夠引起玉米籽粒的不透明(Opaque)性狀(見附圖1和圖2)。prol突變體在很多遺傳背景下(如昌7-2和2674)，能產生ο另ξ變體類似的效應，賴氨酸含量增加，蛋白品質提高(Balconi et al.，1998)。基因至今尚未通過雜交育種被很好地利用，主要是因為由隱性基因突變引起，通過雜交選育需要較長的時間。DNA分子標記輔助育種是一項新的育種技術，該技術是通過利用與目標性狀基因緊密連鎖的DNA分子標記對控制目標性狀的基因進行間接選擇的現代育種技術。該技術對目標基因的轉移，不僅可在早期進行準確、穩定的選擇，而且可克服再度利用隱性基因識別難的問題，從而加速育種進程，提高育種效率。與常規育種相比，該技術可提高育種效率2-3倍。
[0006]DNA分子標記輔助育種技術的關鍵是:(I)獲得的分子標記應該是能夠區分育種過程中雜交親本(純合類型和純合野生型類型)以及它們雜交子代(Fl代)的共顯性引物組；(2)獲得的共顯性分子標記(即引物組)與控制目標性狀基因的連鎖情況，連鎖越緊密在其后代中錯選的概率越低，如果該標記來源于控制目標性狀基因，則利用該分子標記在其后代中錯選的概率為零；(3)該標記可以區分突變體與國內所有主要育種親本。以往研宄中并沒有獲得位于基因上并且與其完全連鎖的共顯性DNA分子標記(即引物組)，故無法對該基因所控制的目標性狀進行DNA分子標記輔助選擇，同時，以往也為獲得能夠區分突變體與國內所有主要育種親本的分析標記。所以，對于該種標記的獲得和鑒定是對控制玉米籽粒高賴氨酸含量農藝性狀的prol基因進行DNA分子標記輔助育種的基礎。
【發明內容】
[0007]本發明的目的之一在于提供一種用于檢測玉米/￥07i/^7基因的引物組。
[0008]本發明的目的之二在于提供該引物組的用途。
[0009]為達到上述目的，本發明采用如下技術方案:
一種用于檢測玉米基因的引物組，其特征在于該引物組的第一對堿基序列為:
正向引物從 5'端至 3'端為:CGGTGTCACACACTCCGCATAC ；
反向引物從 5'端至 3'端為:GAAGGATAGGGCGTTCTTCGAT ；
該引物組的第二對堿基序列為:
正向引物從5'端至3'端為:GGCCGAGGAGGGATACATCA ；
反向引物從5'端至3'端為:CAGCCCTCAGGGAAGCGATA。
[0010]一種上述的用于檢測玉米/￥o7i/7e7基因的引物組在在檢測和區分玉米育種過程中雜交親本以及它們雜交子代類型中的應用。
[0011]本發明提供的2個位于Prol基因染色體物理位置兩側的與其緊密連鎖的共顯性DNA分子標記，以及利用這兩個共顯性DNA分子標記對Prol基因進行分子標記輔助選擇的方法。利用這兩個分子標記能對玉米任何時期和任何組織的DNA進行基因型鑒定，檢測雜交育種子代各單株中Prol基因的存在與否以及雜合或純合狀態。這種檢測方法的準確性高，操作簡單，為利用Prol基因的DNA分子標記輔助育種提供重要的技術手段。
【附圖說明】
[0012]圖1 prol突變