一種試劑盒及其應用、檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及食品領域，特別涉及一種試劑盒及其應用、檢測方法。
【背景技術】
[0002] 阪崎克羅諾桿菌是一種具有周生鞭毛，能運動，無芽孢，兼性厭氧的革蘭氏陰性桿 菌，可引起嬰幼兒死亡，尤其是對早產兒、出生體重輕的嬰兒或免疫受損嬰兒的威脅最大， 嚴重者可導致敗血癥、腦膜炎或壞死性小腸結腸炎，報告病例的病死率達20%~50%，幸 存者常有嚴重的神經系統后遺癥。流行病學研宄顯示，受污染的嬰兒配方奶粉是引發嬰兒、 早產兒感染阪崎克羅諾桿菌的主要渠道。
[0003] 目前嬰兒配方奶粉中阪崎克羅諾桿菌的檢測方法主要通過培養法分離、鑒定，整 個過程操作繁瑣，耗時長，陽性率低。實時熒光PCR方法具有敏感性、特異性和穩定性特性， 可很好的彌補上述不足，現已在嬰兒配方奶粉生產企業廣泛應用。但阪崎克羅諾桿菌在嬰 兒配方奶粉生產過程中經過巴氏殺菌后多數已經死亡，由于DNA在死菌中能保留很長時 間，而傳統的熒光定量PCR方法無法區別死菌和活菌，干擾了檢測的真實性。
【發明內容】
[0004] 有鑒于此，本發明提供一種試劑盒及其應用、檢測方法。本發明提供一種檢測配方 奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌的EM實時熒光PCR試劑盒及檢測方法，實現了對嬰兒配方奶 粉中活的阪崎克羅諾桿菌快速、準確、特異檢測。
[0005] 為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
[0006] 本發明提供了一種試劑盒，包括引物組；所述引物組包括具有如SEQ ID No. 1所示 的上游引物和具有如SEQ ID No. 2所示的下游引物。
[0007] 在本發明的一些具體實施方案中，試劑盒還包括熒光探針。
[0008] 在本發明的一些具體實施方案中，試劑盒中所述熒光探針具有如Y -FAM-SEQ ID No. 3-MGB-3'所不的序列。
[0009] 在本發明的一些具體實施方案中，試劑盒還包括疊氮溴乙錠。
[0010] 在本發明的一些具體實施方案中，試劑盒還包括PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混 合物和DNA聚合酶中的一種或兩者以上的混合物。
[0011] 本發明還提供了所述試劑盒在檢測活的阪崎克羅諾桿菌中的應用。
[0012] 在本發明的一些具體實施方案中，所述試劑盒在檢測活的阪崎克羅諾桿菌中的應 用中所述活的阪崎克羅諾桿菌為嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌。
[0013] 本發明還提供了基于所述試劑盒的檢測活的阪崎克羅諾桿菌的方法，取待測樣品 經預處理后，提取核酸，擴增，CT值小于30,檢測結果為陽性。
[0014] 在本發明的一些具體實施方案中，基于所述試劑盒的檢測活的阪崎克羅諾桿菌的 方法中所述活的阪崎克羅諾桿菌為嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌。
[0015] 在本發明的一些具體實施方案中，基于所述試劑盒的檢測活的阪崎克羅諾桿菌的 方法中所述預處理為所述待測樣品經疊氮溴乙錠處理。
[0016] 在本發明的一些具體實施方案中，基于所述試劑盒的檢測活的阪崎克羅諾桿菌的 方法中，總反應體系25 μ L，包括2 XPremix Ex Taq ? 12. 5 μ L，上、下游引物（20 μ mol/L) 各 0· 3 μ L，探針（20 μ mol/L) 0· 3 μ L，ROX 0· 2 μ L，模板 DNA 各為 5· 0 μ L，用 ddH20 補足。
[0017] 在本發明的一些具體實施方案中，基于所述試劑盒的檢測活的阪崎克羅諾桿菌的 方法中，反應條件為預變性95°C 2min，變性95°C 30s，退火60°C 3〇8,40個循環。在60°〇處 設定熒光檢測點。熒光檢測模式選擇FAM熒光，基線調整取3~15個循環的熒光信號，以 閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線。
[0018] 本發明采用的技術方案是：提供了嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌的EM實 時熒光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒主要包括特異性引物和熒光探針、EM試劑、PCR緩沖 液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶，所述特異性引物和熒光探針序列如下：
[0019] 上游引物：5' -gca caa gcg gtg gag cat-3'
[0020] 下游引物：5' -aac cca aca ttt cac aac acg ag_3'
[0021] 焚光探針：5' -FAM-ctt acc tgg tct tga cat c-MGB-3'
[0022] 其中FAM為熒光報告基團，MGB為熒光淬滅基團。
[0023] 本發明關鍵在于樣品EMA前處理，特異性引物和熒光探針序列的設計及檢測方 法，PCR試劑盒中其他組成，可按本領域常規進行選擇，該試劑盒可用作嬰兒配方奶粉中活 的阪崎克羅諾桿菌的定性檢測，也可加入標準菌株標準品進行定量檢測。
[0024] 以梯度濃度的活阪崎克羅諾桿菌DNA溶液在與樣品DNA相同條件下進行EM實時 熒光PCR擴增反應，以活的阪崎克羅諾桿菌濃度的對數值為橫坐標、Ct值為縱坐標繪制標 準曲線；根據樣品測得的Ct值，對照標準曲線，獲得嬰兒配方奶粉中活阪崎克羅諾桿菌的 濃度。
[0025] 本發明還涉及檢測嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌的EMA實時熒光PCR的檢 測方法，所述方法如下：
[0026] (1)樣品EMA前處理：取樣品lg，加無菌生理鹽水9ml，充分溶解后，
[0027] 3000r/min，lOmin，去上清。加無菌生理鹽水180 μ 1，溶解后移至I. 5mleppendorf 管，加入EMA使其終濃度為30 μ g/ml。在黑暗處放置5min后，于650W鹵素光源光照處理 5min，光源放在離樣品管20cm處，光照時EP管放在冰上，以免樣品溫度過高。同條件重復 進行黑暗處放置、光照處理3次后，用生理鹽水沉淀3次。
[0028] (2)核酸提取：將上述沉淀物，用200 μ 1無菌蒸餾水溶解，置沸水浴lOmin， 1000 Orpm離心5min，吸上清至另一離心管，-40°C保存備用；
[0029] (3)總反應體系：總反應體系25 μ L，包括2 X Premix Ex Taq ? 12. 5 μ L，上、下游 引物（20 μ mol/L)各 0· 3 μ L，探針（20 μ mol/L) 0· 3 μ L，ROX 0· 2 μ L，模板 DNA 各為 5. 0 μ L， 用ddH20補足。
[0030] (4)所述特異性引物和熒光探針序列如下：
[0031] 上游引物：5' -gca caa gcg gtg gag cat-3'
[0032] 下游引物：5' -aac cca aca ttt cac aac acg ag_3'
[0033] 焚光探針：5' -FAM-ctt acc tgg tct tga cat c-MGB-3'
[0034] 其中FAM為熒光報告基團，MGB為熒光淬滅基團。
[0035] (5)反應條件：預變性95°C 2min，變性95°C 30s，退火60°C 30s，40個循環。在 60°C處設定熒光檢測點。熒光檢測模式選擇FAM熒光，基線調整取3~15個循環的熒光信 號，以閾值線剛好超過正常陰性對照的最高點設定閾值線；若待測樣品熒光增長曲線超過 閾值線，并呈良好的對數增長，CT值小于30,則判斷為陽性，即樣本中存在活的阪崎克羅諾 桿菌。
[0036] 本發明建立了利用EM熒光定量PCR技術檢測嬰兒配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿 菌的方法，并經檢測模擬雙盲阪崎克羅諾桿菌污染嬰兒配方奶粉樣本，對死菌DNA去除率、 敏感性、特異性試驗表明該方法切實可行。因為本方法采用了 EM對檢測樣品進行前處理， 避免了由于常規PCR擴增死菌或殘留DNA引起的假陽性率，使得其特異性亦大大提高。而 且由于采用了 TaqMan-MGB探針的熒光PCR擴增技術，使得細菌的檢測敏感性、特異性大大 提尚。
[0037] 本發明的有益效果主要體現在：EMA的應用，避免了由于常規PCR擴增死菌或殘留 DNA引起的假陽性率，使得其特異性亦大大提高。可實現對配方奶粉加工過程中活的阪崎克 羅諾桿菌進行快速、準確、特異檢測。
[0038] 本發明應用疊氮溴乙錠（Ethidiummonoazide bromide，EMA)能穿過死細菌的細胞 膜，在光激活的作用下與基因組DNA共價結合，從而能抑制樣品中死菌體的DNA進行PCR擴 增的特性，將EM與PCR技術結合，建立了活的阪崎克羅諾桿菌實時熒光PCR方法，為嬰兒 配方奶粉中活的阪崎克羅諾桿菌快速、準確、特異檢測提供科學依據。
【附圖說明】
[0039] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0040] 圖1示不同濃度阪崎克羅諾桿菌EM實時熒光PCR擴增結果；其中圖1(A)、圖 I (B)為分別取濃度為 5. 5 X 107cfu/ml，5. 5 X 106cfu/ml，5. 5 X 105cfu/ml，5. 5 X IO4Cfu/ ml，5· 5 X 103cfu/ml，5· 5 X 102cfu/ml，5· 5 X 10cfu/ml 7 種濃度阪崎克羅諾桿菌菌培養 物進行EM實時熒光PCR擴增結果，Ct值與待檢菌濃度對數具有良好線性關系，Ct = 34. 67-3. 13 X log (菌濃度），相關系數（r)為0. 998 ;方法的最低檢測濃度達到55cfu/ml ; 橫坐標代表循環次數，縱坐標代表熒光強度；
[0041] 圖2示EMA熒光定量PCR技術特異性結果；橫坐標代