利用轉基因動物乳腺生物反應器生產單克隆抗體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制藥技術領域，具體地涉及利用轉基因動物乳腺生物平臺大規模 生產重組單克隆抗體的方法。
【背景技術】
[0002] 過去的四十年中，生物制藥技術發展非常迅速。生物藥品具有療效好，副作用小， 適應癥廣等優點，成為各種投資，尤其是大型制藥公司投資研發的熱點。生物藥品的生產方 法可分為二大類，一是將特定的生物藥物編碼基因序列導入至工程菌或生物細胞中，經細 菌，酵母，或哺乳動物和人類細胞發酵培養，分離純化而得到。微生物和酵母發酵培養只適 合于結構相對簡單蛋白，如胰島素和生長激素等培養生產，但對結構和翻譯后修飾相對復 雜的蛋白，如單克隆抗體等的生產并不適用。哺乳動物和人類細胞培養能克服微生物和酵 母發酵的缺點，但早期投資成本高，風險較大，缺乏擴大或縮小規模靈活性，及消耗大量細 胞培養液體和耗材。這樣就產生了第二種生產方法即轉基因動物制藥。該方法將藥物蛋白 基因導入到動物體內，例如牛或山羊，然后使藥物從乳腺或其它器官中生產出來，通過提純 等工序制成生物藥品。此法的特點是產量高，成本低，藥物生物學活性穩定，高產量，高質 量，能耗低，無污染。近年來，由于基因工程技術的不斷完善和動物克隆技術的發明，轉基因 動物制藥已成為研發非常活躍的領域。西方發達國家已有三十多年轉基因動物制藥開發歷 史，技術已趨成熟。
[0003] 自從Kohler和Milstein在1975年發明了一種制作單克隆抗體的新方法后，人們 開始意識到單克隆抗體在診斷、預防、治療癌癥和許多其他重大疾病及免疫機制研宄方面 的巨大潛力。1986年，美國FDA批準了第一個人類治療用單克隆抗體，Murononab-3。目前 為止，共有約20多個單克隆抗體用于臨床，還有200多個仍處于不同臨床實驗階段。
[0004] 最早的單克隆抗體是從免疫后的小鼠產生，如作為生物制劑應用于人體時，則因 是異性蛋白可引起過敏反應，嚴重時可發生腎功能衰竭，甚至危及生命。為克服此問題，研 宄人員將鼠源性負責抗原結合的抗體可變區與人源性抗體恒定區融合，所產生的嵌合型抗 體約70%屬人源性，可減低人體免疫反應，但不能完全消除。新技術的發展使得單克隆抗體 鼠源性可變區部分更進一步降低，甚至幾乎被人源性蛋白序列所替代。所產生的"人源性" 單克隆抗體含85-90%人類序列，但技術比產生嵌合型抗體更為復雜。此外，單克隆抗體人 源化有可能引起抗體失活。目前市場上大部分單克隆抗體藥物屬嵌合型或人源性抗體。
[0005] 單克隆抗體還能通過噬菌體和酵母展示等技術獲取。但噬菌體展示庫只含單克隆 抗體片段，很少含抗體全序列片段。并且，抗體蛋白是通過低等動物細菌表達，活性較低。通 過酵母展示技術而篩選出的單克隆抗體或抗體片斷，其翻譯后修飾比細菌表達蛋白更接近 高等生物，但與人類還是不盡相同。另外，能用轉基因動物產生治療用人類基因源性單克隆 抗體。當應用抗原接種時，這些轉基因動物如小鼠能產生全人源單克隆抗體，從而克服抗體 人源化的技術難題。但該技術受限于只能產生小鼠免疫系統可識別的單克隆抗體。
[0006] 綜上所述，現有技術中的各種系統或者不能生產或分離純化足夠數量具活性的人 源性單克隆抗體，這些治療用單克隆抗體藥物通常的市場總需求量達250-1000公斤，或者 所生產的具活性的人源性單克隆抗體產品不均一化，并且生產工藝復雜，造價昂貴。因此本 領域迫切需要開發新的穩定、高效、簡便、經濟、適合大規模生產和應用的制備單克隆抗體 的方法。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的就是提供一種高效、簡便、適合大規模生產和應用的制備單克隆抗 體的方法。
[0008] 本發明的第一方面，提供了一種用于乳腺特異表達的供體構建物，其特征在于，所 述構建物從5'至3'，依次包括可操作性連接的式I中所示的元件：
[0009] Al-Bl-Cl-Dl-E-Fl (式 I)
[0010] 式中，
[0011] ⑴Al為5'同源臂序列，所述5'同源臂序列選自哺乳動物乳腺特異表達蛋白基 因組序列，所述的哺乳動物乳腺特異表達蛋白包括：乳清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白， aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0012] (ii)Bl為剪接接受位點序列；
[0013] (iii) Cl為含Kozak序列，信號肽編碼序列和重組蛋白的編碼序列，所述重組蛋白 編碼序列編碼形成抗體的抗體元件，其中所述的抗體元件選自下組：抗體輕鏈、抗體重鏈、 單鏈形式或完整的單克隆抗體；
[0014] (iv)Dl為終止密碼子以及位于所述密碼子下游的抗體蛋白cDNA 3'末端UTR序 列；
[0015] (V)E為抗性基因以及位于抗性基因兩側的Cre - IoxP序列；
[0016] (Vi)Fl為位于基因定點整合位點下游的3'同源臂序列，所述的3'同源臂序列 選自哺乳動物乳腺特異表達蛋白基因組序列，所述的哺乳動物乳腺特異表達蛋白包括：乳 清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和 α_乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列來自同一蛋白的基因組序列，并且 用于將外源基因定點整合入所述蛋白基因組序列的內含子1區域。
[0017] 在另一優選例中，所述的5'同源臂含有對應于酪蛋白El外顯子及其下游的部分 內含子1序列（如GenBank AF4409096中第3721位-5760位），而3'同源臂含有對應于酪 蛋白的部分內含子1序列和E2外顯子序列和任選的E2外顯子序列的下游序列（如GenBank AF440906中第5761位-7800位），從而將同源重組的插入位點限定為酪蛋白的內含子1區 域。
[0018] 本發明的第二方面，提供了一種用于乳腺特異性表達的構建物，其特征在于，所述 的構建物從5'至3'依次包括可操作性連接的式II中所示的元件：
[0019] A2-B2-C2-D2-E-F2 (式 II)
[0020] 式中，
[0021] (i)A2為5'同源臂序列，所述5'同源臂序列選自哺乳動物乳腺特異表達蛋白基 因組序列，所述的哺乳動物乳腺特異表達蛋白包括：乳清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白， aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和α-乳清蛋白；
[0022] (ii)B2為連接肽的編碼序列，所述的連接肽為2A多肽或其衍生多肽，用于連接上 游乳腺特異表達蛋白和下游重組單克隆抗體蛋白C2,該元件經蛋白酶酶切后，其序列保留 于與之連接的上游乳腺特異表達蛋白，將C2從所述上游乳腺特異表達蛋白切下釋放而形 成一新的重組單克隆抗體蛋白；
[0023] (iii)C2為含重組單克隆抗體蛋白編碼序列，用于形成抗體的抗體元件，其中所述 的抗體元件選自下組：抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈形式或完整的單克隆抗體；
[0024] (iv)D2為終止密碼子或無；
[0025] (V)E為抗性基因以及位于抗性基因兩側的Cre - IoxP序列；
[0026] (vi)F2為位于基因定點整合位點下游的3'同源臂序列，所述的3'同源臂序列 選自哺乳動物乳腺特異表達蛋白基因組序列，所述的哺乳動物乳腺特異表達蛋白包括：乳 清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋白，β-乳球蛋白和 α_乳清蛋白；并且所述5'同源臂序列和3'同源臂序列來自同一蛋白的基因組序列，并且 用于將外源基因定點整合入所述蛋白基因組序列的終止密碼子之前。
[0027] 在另一優選例中，所述的5'同源臂含有對應于酪蛋白E8外顯子序列（如GenBank AF409096中第10461位一 12466位），而3'同源臂含有對應于酪蛋白的3' 一 UTR序列（如 GenBank AF409096中第12470位一 13671位），從而將同源重組的插入位點限定為酪蛋白 的E8外顯子和3' 一 UTR之間。
[0028] 本發明的第三方面，提供了一種用于乳腺特異性表達的抗體元件表達盒，其特征 在于，所述表達盒從5'至3'，依次包括可操作性連接的以下元件：
[0029] ⑴絕緣體片段；
[0030] (ii)任選的哺乳動物乳腺特異表達蛋白基因啟動子序列，所述的哺乳動物乳腺特 異表達蛋白包括：乳清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白，aS2_酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪蛋 白，β -乳球蛋白和a -乳清蛋白；
[0031] (iii)至少一個信號肽編碼序列（如酪蛋白信號序列、免疫球蛋白信號序列肽）， 所述信號肽編碼序列提供表達重組單克隆抗體蛋白分泌的信號肽；
[0032] (iv)重組單克隆抗體蛋白編碼序列，用于形成抗體的抗體元件，其中所述的抗體 元件選自下組：抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈形式或完整的單克隆抗體；
[0033] (V)終止密碼子以及位于所述密碼子下游的抗體元件cDNA 3'末端UTR序列；
[0034] (vi)任選的哺乳動物乳腺特異表達蛋白基因3'末端序列，所述的哺乳動物乳腺 特異表達蛋白包括：乳清酸性蛋白（WAP)，a Sl-酪蛋白，a S2-酪蛋白，β-酪蛋白，K-酪 蛋白，β-乳球蛋白和a-乳清蛋白；
[0035] (Vii)供哺乳動物細胞選擇的新霉素，或嘌呤霉素抗性基因序列。
[0036] 并且，當所述表達盒整合入哺乳動物細胞后，經核移植使轉基因哺乳動物乳腺表 達并分泌所述的重組單克隆抗體蛋白。
[0037] 在另一優選例中，所述的絕緣體片段可位于（Vii)之后。
[0038] 在另一優選例中，所述的新霉素，或嘌呤霉素抗性基因可位于元件α)之前、元件 ⑴與（ii)之間。
[0039] 在另一優選例中，所述的抗體為人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、或其組合。
[0040] 在另一優選例中，所述的抗體元件為抗體輕鏈、抗體重鏈、單鏈形式或完整的單克 隆抗體。
[0041] 在另一優選例中，所述的抗體元件的氨基酸序列如SEQ ID No. :1所示。
[0042] 在另一優選例中，所述的抗體元件的DNA編碼序列如SEQ ID No. :2所示。
[0043] 在另一優選例中，本發明還提供了一種用于乳腺特異性表達的抗體元件表達盒， 所述表達盒從5'至3'，依次包括可操作性連接的以下元件：
[0044] (i)任選的酪蛋白啟動子或乳清酸性蛋白質（WAP)啟動子序列；
[0045] (ii)至少一個信號肽編碼序列（如酪蛋白信號序列、免疫球蛋白信號肽），所述信 號肽編碼序列提供表達外源融合蛋白分泌的信號肽；
[0046] (iii)外源融合蛋白編碼序列，所述編碼序列編碼式III結構的外源融合蛋白
[0047] FA- FLl- FB1-FB2- FL2- FC (式 III)
[0048] 式中，
[0049] FA為源自酪蛋白的酪蛋白元件；
[0050] FLl為無或連接肽元件；
[0051] FBl為2A序列元件；
[0052] FB2為無或蛋白酶切識別序列，其中經蛋白酶酶