具有顯著促進牛前脂肪細胞增殖生物功能的miRNA-2400的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及具有顯著促進牛前脂肪細胞增殖生物功能的miRNA-2400,屬于細胞生 物學技術領域。
【背景技術】
[0002] 前脂肪細胞的分化與增殖，是導致肥胖的直接因素。利用體外培養的前脂肪細胞 研宄細胞的增殖與分化規律，是近年來科研人員常用的方法。體外前脂肪細胞的培養是研 宄脂肪組織的理想模型。研宄家畜脂肪蓄積情況，對于探討脂肪代謝相關疾病，優化家畜 肌肉品質具有重要價值。本研宄對牛的前脂肪細胞進行分離，建立其體外培養的方法，并 誘導分化使其成為成熟的脂肪細胞，對脂肪細胞中的標志性分子脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARy)進行免疫熒光染色，以證明分離 的前脂肪細胞的性質和純度。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase, LPL)是一種脂肪細胞的 特征蛋白，是脂肪細胞早期分化的標志基因 （Couturier et al, 1998)。LPL能夠將血液中 乳糜微粒和極低密度脂蛋白所攜帶的甘油三酯分解成甘油和脂肪酸，向有關組織提供合成 甘油三酯所需的原料，對脂肪沉積起著重要的調控作用（Mead et al，2002)。過氧化物酶體 增殖物激活受體（PPAR)家族是影響脂肪細胞分化和脂質代謝的主要核內轉錄受體，有3種 亞型，即PPARa、PPAR β (亦稱PPAR δ )和PPARy，它們在結構、功能及組織分布上均有差 異。其家族成員PPARy是目前所知唯一在脂肪組織中高水平表達的轉錄因子，對脂肪細胞 的分化有重要調節作用。PPARγ在脂肪細胞分化的早期即在大多數脂肪細胞基因轉錄激活 前即有表達，在脂肪細胞分化過程中，PPAR γ表達水平不斷升高，到成熟脂肪細胞表達最高 (程安瑋等，2009)。MicroRNA (miRNA)是一類內生的、長度約20-24個核苷酸的小RNA，是發 夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成。其在細胞內具有 多種重要的調節作用。每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調節同一個基 因。這種復雜的調節網絡既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個 miRNAs的組合來精細調控某個基因的表達。隨著miRNA調控基因表達的研宄的逐步深入， 將幫助我們理解高等真核生物的基因組的復雜性和復雜的基因表達調控網絡。miRNA廣泛 存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質的短序列RNA，其本身不具有開放閱讀框（ORF)。 成熟的miRNA，5^端有一個磷酸基團，3'端為羥基。編碼miRNAs的基因最初產生一個長的 pri-RNA分子，這種初期分子還必須被剪切成約70-90個堿基大小、具發夾結構單鏈RNA前 體（pre-miRNA)并經過Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5 ^端的磷酸基團和3'端輕 基則是它與相同長度的功能RNA降解片段的區分標志。miRNA 5 '端第一個堿基對U(尿 苷）有強烈的傾向性，而對G卻排斥，但第二到第四個堿基缺乏U。一般來講，除第四個堿基 外，其他位置堿基通常都缺乏C。這些分子能夠與那些和它的序列互補的mRNA分子相結合， 有時候甚至可以與特定的DNA片斷結合。這種結合的結果就是導致基因的沉默。這種方式 是身體調芐基因表達的一個重要策略。據推測，miRNA調節著人類三分之一的基因。成熟 的miRNA-2400的核酸序列為：CCAGCACAGGCAGCUCGGACUGA，目前國內外還沒有miRNA-2400 是否具有促進牛前脂肪細胞增殖生物學功能的相關報道。如何研宄miRNA-2400是否具有 促進牛前脂肪細胞增殖的生物學功能成為急需解決的一大難題？所以，發明具有顯著促進 牛前脂肪細胞增殖生物功能的miRNA-2400,研宄miRNA-2400是否具有促進牛前脂肪細胞 增殖的生物功能是必要的。
【發明內容】
[0003] 為了研宄miRNA-2400是否具有促進牛前脂肪細胞增殖的生物功能的難題，本發 明提供了具有顯著促進牛前脂肪細胞增殖生物功能的miRNA-2400,本發明對牛前脂肪細 胞進行體外分離培養，并采用免疫熒光染色法鑒定牛脂肪前體細胞，在牛的前脂肪細胞分 化為脂肪細胞的過程中，采用莖環熒光定量RT-PCR檢測miRNA-2400的表達量，構建能夠 使miRNA-2400過表達的真核表達載體，采用EdU檢測miRNA-2400對前脂肪細胞增殖的影 響；結果為：在牛的前脂肪細胞分化為脂肪細胞的過程中，隨著分化天數和分化程度的增 加，miRNA-2400的表達量明顯下降，miRNA-2400過表達后，前脂肪細胞的增殖率明顯提高， miRNA-2400過表達后，與增殖相關的基因 CCNDl表達量明顯上升；結果表明：miRNA-2400 是一種在調解脂肪細胞發育過程中具有顯著促進前脂肪細胞增殖作用的小RNA。
[0004] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0005] 具有顯著促進牛前脂肪細胞增殖生物功能的miRNA-2400通過對牛前脂肪細胞 進行體外分離培養，采用免疫熒光染色法鑒定牛脂肪前體細胞，在牛的前脂肪細胞分化為 脂肪細胞的過程中，采用莖環熒光定量RT-PCR檢測miRNA-2400的表達量，采用EdU檢測 miRNA-2400對前脂肪細胞增殖的影響；結果為：在牛的前脂肪細胞分化為脂肪細胞的過程 中，隨著分化天數和分化程度的增加，miRNA-2400的表達量明顯下降，miRNA-2400過表達 后，前脂肪細胞的增殖率明顯提高，miRNA-2400過表達后，與增殖相關的基因 CCNDl表達量 明顯上升；結果表明：miRNA-2400在調解脂肪細胞發育過程中具有顯著促進前脂肪細胞增 殖的作用。
[0006] 所述的免疫熒光染色法鑒定牛脂肪前體細胞的鑒定結果：采用50納摩爾每升的 胰島素和100納摩爾每升的地塞米松，進行脂肪前體細胞的誘導分化，在誘導分化7天后， 熒光顯微鏡下觀察到PPARy和LPL在細胞中的表達情況。結果表明，在前脂肪細胞分化為 脂肪細胞后，PPARy和LPL在細胞具有陽性表達信號，從而證明本研宄分離培養的為前脂 肪細胞，且具有分化為脂肪細胞的能力。
[0007] 所述的在牛的前脂肪細胞分化為脂肪細胞的過程中，采用莖環熒光定量RT-PCR 檢測miRNA-2400的表達量，方法為選取出于對數生長期的前脂肪細胞，將其進行細胞傳代 培養操作，傳至12孔細胞培養板，用胰島素和地塞米松誘導分化4天、7天、10天，收集細 胞，檢測miRNA-2400表達量。實驗結果：在牛的前脂肪細胞分化為脂肪細胞的過程中，隨著 分化天數和分化程度的增加，miRNA-2400的表達量明顯下降。表明miRNA-2400在調解脂 肪細胞發育過程中具有一定的作用。
[0008] 所述的EdU檢測miRNA-2400對前脂肪細胞增殖的影響：選取出于對數生長期的前 脂肪細胞，將其進行細胞傳代培養操作，傳至24孔板，待細胞貼壁后，采用PEI法進行前脂 肪細胞的轉染，pcDNA3. I (+)、pcDNA3. I (+) -miRNA-2400 (含有 miRNA-2400 的過表達載體）， miRNA-2400的抑制劑，48h后EdU檢測其增殖情況。同時采用熒光定量RT-PCR的方法檢測 增殖相關重要基因 CCNDl [G1/S-特異性周期蛋白-D1，該基因編碼的蛋白質屬于高度保守 的周期蛋白家族，該家族成員的顯著特征是貫穿細胞周期，其蛋白質豐度周期性地急劇改 變。周期蛋白作為CDK(周期蛋白依賴性激酶）的調節因子。EdU結果表明，miRNA-2400過 表達后，前脂肪細胞的增殖率明顯提高，證明miRNA-2400能夠顯著促進前脂肪細胞增殖。 CCNDl表達量的熒光定量RT-PCR檢測結果表明：miRNA-2400過表達后，與增殖相關的基因 CCNDl表達量明顯上升。證明了 miRNA-2400能夠促進前脂肪細胞的增殖。
[0009] 本發明的有益效果為：miRNA-2400為牛中特異性表達的miRNA，其序列特征已經 公布，但其生物功能未知，本研宄發現miRNA-2400在牛的前脂肪細胞的分化過程中表達量 下降，說明其能夠調控脂肪細胞的增殖和分化，本研宄通過實驗證明miRNA-2400能夠促進 前脂肪細胞的增殖，其可以作為研宄牛脂肪細胞中脂肪的沉積作用的新的miRNA，對調解家 畜肉質的生產具有一定的意義。
【附圖說明】
[0010] 下面結合附圖對本發明進一步說明。
[0011] 圖1為miR-2400促進牛前脂肪細胞增殖生物功能的研宄的miR-2400在miRBase 數據庫中的基本信息圖。
[0012] 圖2為miR-2400促進牛前脂肪細胞增殖生物功能的研宄的miR-2400的莖環序列 信息圖。
[0013] 圖3為miR-2400促進牛前脂肪細胞增殖生物功能的研宄的成熟miR-2400序列具 體信息圖。
[0014] 圖4為miR-2400促進牛前脂肪細胞增殖生物功能的研宄的熒光顯微鏡下觀察到 PPAR γ和LPL在細胞中的表達情況圖（放大倍數200倍）。圖中，I. PPAR γ在成熟脂肪細 胞中的表達情況，2. LPL在成熟脂肪細胞中的表達情況。
[0015] 圖5為miR