一種用于動物組織基因組dna和rna快速提取試劑盒及提取方法和應(yīng)用

一種用于動物組織基因組dna和rna快速提取試劑盒及提取方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于動物組織基因組DNA和RNA快速提取試劑盒及提取方法和應(yīng) 用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子生物學(xué)研宄中提取純化DNA和RNA是分子試驗的第一步，各種臨床檢測或科 研中均需要提取純化DNA和RNA。目前，國內(nèi)外已有多種基于PCR、RT-PCR技術(shù)檢測DNA和 RNA的試劑盒應(yīng)用于臨床診斷和檢測中，這些試劑盒所提供的DNA和RNA提取方法主要是苯 酚-氯仿提取法。苯酚、氯仿是DNA和RNA提取過程的變性劑，反復(fù)抽提可以去除蛋白質(zhì)、 鹽類和雜質(zhì)。但苯酚和氯仿對人體有較大毒性，揮發(fā)性較強，并且整個提取過程步驟繁瑣， 耗時較長，往往容易導(dǎo)致DNA和RNA的降解，并且增加能耗和試驗成本，對下游實驗往往造 成不利影響。
[0003] 全基因組是細胞或組織中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部基因信息，幾乎 所有的生命信息均可以從全基因組中發(fā)現(xiàn)，包括與動物疾病相關(guān)的基因表達與調(diào)控。目前， 病原學(xué)檢測與分子診斷是臨床檢測中常見的技術(shù)，其敏感性、特異性與DNA和RNA提取的純 度和濃度有很大關(guān)系，直接決定了檢測結(jié)果。在動物疾病檢測與分子診斷中，高靈敏度與特 異性的分子診斷已逐步取代血清學(xué)檢查。因而，獲取高純度與高濃度的基因組DNA和RNA 是動物病原菌科研和臨床檢測中的第一步，其決定了擴增結(jié)合和診斷的特異性。
[0004] DNA和RNA的提取是分子生物學(xué)研宄中常用的一種技術(shù)，目前市場上有多種DNA 和RNA提取方法。動物組織中含有大量的蛋白質(zhì)、鹽類及雜質(zhì)，其性質(zhì)與核酸的性質(zhì)非常相 似，難以從提取的DNA和RNA中分離出，在動物組織的DNA和RNA提取過程中，很容易與DNA 和RNA共同沉淀，并且難以分離，往往造成提取的DNA和RNA純度和濃度不夠，影響了后續(xù) 的擴增和測序。
[0005] 為降低或清除動物組織中的蛋白質(zhì)、鹽類及雜質(zhì)，現(xiàn)有的DNA和RNA提取過程中常 常有污染，并且步驟繁瑣，提取過程時間較長。如高氯酸鈉法、SDS法和尿素法等提取方法， 但這些方法需要樣本量較大，并且苯酚類等有機物容易在DNA和RNA溶液中殘留，特別是在 后續(xù)的PCR、RT-PCR擴增過程中會干擾擴增過程，影響擴增結(jié)果，使得該方法的應(yīng)用受到一 定的限制。
[0006] 目前市場上采用的方法為：（1)采用氯仿、苯酚抽提法來去除蛋白質(zhì)、鹽類和雜 質(zhì)。（2)提取DNA和RNA的首要步驟為裂解樣品，目前市場上公開的方法為多為水浴裂解 15分鐘到1個小時，裂解時間較長，增加了檢測成本。
[0007] 對于動物組織而言，采用分子生物學(xué)方法來研宄其病原菌診斷，首先要進行的就 是樣品中細菌或病毒的DNA和RNA提取。能獲取不同種類細菌和病毒的DNA及RNA，以及基 因組的完整性、純度和濃度，是從動物組織中提取DNA和RNA用于動物病原菌診斷研宄的首 要目標(biāo)。因此，需要一種適于用于動物基因組DNA和RNA超級快速提取試劑盒，才能滿足當(dāng) 前快速分子診斷的需求，保障畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的：在于提供一種用于動物組織基因組DNA和RNA快速提取試劑盒及 其應(yīng)用，本方法操作簡便、省工省時，可以滿足樣品較多和快速提取DNA、RNA的需求，為動 物病原菌快速診斷和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的： 一種用于動物組織基因組DNA和RNA的快速提取試劑盒，包括以下試劑：裂解液、沖洗 液1、沖洗液2、無水乙醇和重量比為0. 5~1. 5%的焦碳酸二乙酯水溶液，其中裂解液、沖洗液 1、沖洗液2的組成分別為： (1) 裂解液：EDTA 30~50 mM，重量比1~3%的聚乙二醇辛基苯基醚，異硫氰酸酯1~3 M， 0. 5~0. 9 M氯化鈉； (2) 沖洗液I :5~15 mM EDTA，體積比70%的乙醇，pH 7. 0 ; (3) 沖洗液2 :含有65~85 mM Tris-HCl，體積比80%的乙醇，pH 7. 0。
[0010] 所述的用于動物組織基因組DNA和RNA的快速提取試劑盒，其中：焦碳酸二乙酯水 溶液的濃度為1% ; 裂解液：EDTA 40禮，重量比2%的聚乙二醇辛基苯基醚，異硫氰酸酯2 M，0.7 M氯化 鈉； 沖洗液I :10 mM EDTA，體積比70%的乙醇，pH 7. 0 ; 沖洗液2 :含有75 mM Tris-HCl，體積比80%的乙醇，pH 7. 0。
[0011] 一種利用所述的DNA和RNA快速提取試劑盒提取動物組織基因組的方法，包括以 下步驟： (1)將固體狀的動物組織先進行研磨處理，液體狀的動物組織直接用于提?。?(1) 取液體狀動物組織20 μ 1~100 μ 1，或取研磨后的固體狀動物組織20mg~100 mg， 加500 μL裂解液，70°C水浴3-5 min，12000 rpm 30 S，分離出上清液； (2) 將上清液轉(zhuǎn)入離心管中，加500 μ 1無水乙醇，分次轉(zhuǎn)到DNA和RNA純化柱上， 12000 rpm離心30 S ;得到粗提的DNA和RNA，倒掉收集管中的廢液； (3) 用500 μ 1沖洗液1沖洗純化柱，12000 rpm離心30 S，倒掉收集管中的廢液； (4) 用600 μ 1沖洗液2沖洗純化柱，12000 rpm離心30 S，倒掉收集管中的廢液； (5) 用500 μ 1沖洗液2沖洗純化柱，12000 rpm離心30 S，倒掉收集管中的廢液； (6) 再次12000離心30 S，得到DNA和RNA ; (7) 將DNA和RNA純化柱轉(zhuǎn)到另一離心管，加50 μ 1焦碳酸二乙酯水溶液，12000離 心30 S，即可得到高純度的病毒及組織基因組的DNA和RNA，于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0012] 所述固體狀的動物組織為心臟、肝臟、肺臟、脾臟或腎臟；所述液體狀的動物組織 為全血、血漿、血清或動物分泌物。
[0013] 所述的試劑盒在用于動物組織基因組DNA和RNA快速提取中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的積極有益效果： 本發(fā)明的動物組織基因組DNA和RNA快速提取試劑盒，可以快速提取動物組織的DNA 和RNA，用于動物病原菌的快速診斷，又可以用于分子遺傳學(xué)研宄、臨床基因診斷及動物疾 病診斷。本發(fā)明的試劑盒也可以用于其他同類組織DNA和RNA的提取和病原菌的診斷。
[0015] 本發(fā)明的試劑盒DNA和RNA提取效率高、檢測靈敏度高，為早期診斷各類DNA和 RNA細菌或病毒病原體感染和早期診斷提供可靠的實驗依據(jù)。
[0016] 本發(fā)明的試劑盒中的樣品經(jīng)過裂解后，基因組DNA和RNA分別被吸附在DNA和RNA 吸附柱上，然后用DEPC水沖洗即可得到全基因組的DNA和RNA，提取過程中DNA和RNA所用 試劑相同，不同之處就是DNA純化柱和RNA純化柱。操作簡便、省工省時，提取速度超快，整 個提取過程只需5分鐘，可以滿足樣品較多和快速提取DNA和RNA的需求，為動物病原菌快 速診斷和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。
[0017] 本發(fā)明的試劑盒用于提取動物組織(如心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟)、全血、血漿、 血清和動物分泌物(乳液、鼻液）的基因組DNA和RNA，此基因組DNA和RNA可用于RT-PCR 反應(yīng)、RAPD、AFLP、RFLP及病毒基因組擴增。
[0018] 本發(fā)明適用于科研單位臨床病原檢測、分子遺傳學(xué)研宄、臨床基因診斷及動物疾 病診斷和疾病控制中心，具有廣闊的市場前景和較好的經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1 : 一種用于動物組織基因組DNA和RNA快速提取試劑盒及提取方法 (1)試劑盒試劑：包括裂解液、沖洗液1、沖洗液2和無水乙醇和濃度為1%的焦碳酸二 乙酯水溶液； 裂解液：EDTA 40 mM (mmol/L)，重量比2%的聚乙二醇辛基苯基醚，異硫氰酸酯2 M (mol/L)，0. 7 M 氯化鈉； 沖洗液1 :10 mM EDTA，體積比70%的乙醇，pH 7. 0 ; 沖洗液2 :含有75 mM Tris-HCl，體積比80