一種新型溫度響應性無機焦磷酸酶偶聯物的合成及其在增強聚合酶鏈式反應中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于聚合物蛋白質偶聯技術及其在生物學應用領域，具體涉及一種新型溫度響應性的無機焦磷酸酶的合成，通過修飾有硫代吡啶基團的溫度響應性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)與定點突變含有巰基的無機焦磷酸酶(PPase)進行定位共價結合，獲得偶聯物并促進聚合酶鏈式反應(PCR)的效率增強。
【背景技術】
[0002]聚合酶鏈式反應(PCR)是一項在體外模擬DNA復制過程的生物學技術，它在現代分子生物學研宄，生物基因工程以及臨床醫學檢測等領域發揮著至關重要的作用。但是研宄發現，在該反應的進行過程當中，會產生大量副產物焦磷酸根離子(P2074_，PPi)，PPi的存在會阻礙反應向正方向進行，導致PCR效率的下降，因此清除PPi是提高PCR效率的關鍵。
[0003]通常，包括焦磷酸在內的多磷酸結構的物質水解非常緩慢，運用化學手段清除PPi需要在高濃度的酸性介質中，這顯然與弱堿性的PCR反應條件存在很大的差異，而生物體內擔負快速有效清除PPi的蛋白質是無機焦磷酸酶(PPase)，其能夠將PPi催化分解成磷酸根(P043_，Pi)，因此利用酶催化反應，這一專一而高效的生物學手段，可以有效促進PCR的效率。但PCR通常需要在60°C以上的高溫環境下進行l_3h，這就給PPase在PCR中的應用帶來了挑戰。雖然可以在自然界，通過某些耐高溫的嗜熱菌中提取出具有耐高溫性質的PPase，但是獲得，篩選，提取這類嗜熱微生物非常困難，對其培養和表達需要特殊環境要求，即便是已經商品化的耐熱型酶，例如從嗜熱脂肪芽孢桿菌中提取的PPase，其酶活力也遠低于通常用大腸桿菌提取的PPase。大腸桿菌作為常用的工程菌，從中提取的PPase酶活力超過800 units/mg,顯示其高活性的特點，但是其最適反應溫度只有45_50°C左右，不僅無法達到PCR反應溫度的要求，而且該蛋白質在高溫條件下也容易變性失活，這就需要對大腸桿菌的PPase進行改性以提高其最適反應溫度以及耐熱性，對于促進PCR效率具有很大的潛力。
【發明內容】
[0004]本發明克服了現有技術的不足，提供一種增強聚合酶鏈式反應(PCR)效率的策略，利用聚合物-蛋白質偶聯技術，在無機焦磷酸酶(PPase)活性中心附近定位修飾上溫度響應性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)，增強蛋白質的熱穩定性以適應PCR高溫長時間循環的條件，利用自身催化分解焦磷酸的能力，達到增強PCR的效果。
[0005]為了實現上述目的，本發明的技術方案:一種新型溫度響應性無機焦磷酸酶偶聯物(PN1-PPase)的合成方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)定點突變構建無機焦磷酸酶突變體:通過將無機焦磷酸酶活性中心附近引入巰基，得到無機焦磷酸酶突變體；
(2)制備溫度響應性聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺:控制N-異丙基丙烯酰胺單體與鏈轉移劑的投料比，聚合得到不同分子量的聚N-異丙基丙烯酰胺聚合物；
(3)制備硫代吡啶基團的聚合物:在所述聚合物末端修飾上硫代吡啶基團；
(4)制備聚N-異丙基丙烯酰胺-無機焦磷酸酶偶聯物(PN1-PPase):控制修飾有硫代吡啶基團的聚合物與無機焦磷酸酶突變體的比例，通過硫代吡啶與無機焦磷酸酶突變體活性中心附近的巰基進行反應得到偶聯物(PN1-PPase )。
[0006]進一步，步驟(I)中的巰基是通過定點突變技術引入的，即將無機焦磷酸酶活性中心附近引入半胱氨酸巰基，從而使得無機焦磷酸酶活性中心附近引入巰基。
[0007]進一步，步驟(2)中的聚合反應為可逆加成斷裂鏈轉移聚合反應。
[0008]進一步，步驟(3 )中，修飾上硫代吡啶基團的聚合物是向步驟(2 )中的聚N-異丙基丙烯酰胺聚合物內加入乙醇胺和二硫代二吡啶后得到的。
[0009]進一步，獲得偶聯物(PN1-PPase)，并測定其在聚合酶鏈式反應儀循環不同次數下的活性變化，包括以下步驟:
(1)將偶聯物(PN1-PPase)放置于聚合酶鏈式反應儀中循環20-100次；
(2)以焦磷酸鈉(Na4P2O7)為底物，測定偶聯物在不同循環次下的活性變化情況。
[0010]本發明的第二種技術方案為:一種將偶聯物(PN1-PPase)應用于聚合酶鏈式反應的方法，其特征在于:將偶聯物(PN1-PPase)加入聚合酶鏈式反應體系中，以增強促進聚合酶鏈式反應的效率。
[0011]進一步，將偶聯物(PN1-PPase)加入到聚合酶鏈式反應體系中，用于促進聚合酶鏈式反應的效率，其特征在于，包括以下步驟:
(1)在聚合酶鏈式反應體系中加入偶聯物(PN1-PPase)，在體系中循環若干次；
(2)擴增后的聚合酶鏈式反應用瓊脂糖凝膠電泳進行表征。
[0012]本發明的第三種技術方案為:一種偶聯物(PN1-PPase)在不同溫度下的活性測定以及不同時間下的熱穩定性測定，包括以下步驟:
(1)測定偶聯物(PN1-PPase)在25_90°C的比活值:選用焦磷酸鈉(Na4P2O7)作為底物，測定偶聯物(PN1-PPase) —定時間內產生的磷酸根含量，計算出相應溫度下的比活值；
(2)測定偶聯物(PN1-PPase)在60°C左右溫度下的熱穩定性情況:在60°C下分別熱處理不同時間，測定偶聯物(PN1-PPase)的活性變化情況。
[0013]進一步，還包括一種篩選后并應用于聚合酶鏈式反應的方法，包括以下步驟，選取所述測定后熱穩定性表現最好的偶聯物(PN1-PPase)，將其加入聚合酶鏈式反應體系中，并在所述聚合酶鏈式反應體系中循環若干次。
[0014]一種新型溫度響應性無機焦磷酸酶偶聯物的合成及其在增強聚合酶鏈式反應中的應用，包括以下步驟:
(I)調節NIPAM與鏈轉移劑(CTA)的比例制備出不同分子量的聚合物PNIPAM，并修飾上硫代R比啶基團，與PPase活性中心附近的巰基進行共價結合制備出PN1-PPase偶聯物。
[0015](2)分別將所得偶聯物進行25-90°C的活性測試以及60°C下10_180min的熱穩定性測試。
[0016](3)將熱穩定性表現最好的偶聯物加入到PCR反應體系中，通過20次循環后，研宄PCR擴增效率情況。
[0017](4)將熱穩定性表現最好的偶聯物放置于PCR儀中循環熱處理20-100次后，對其活性進行測試。
[0018]本發明原理:通過在PPase活性中心定位共價修飾上溫度響應性聚合物PNIPAM，通過PNIPAM在高溫下對活性中心結構的保護和穩定作用，增強蛋白質在高溫下的耐熱性，以適應PCR的長時間的高溫環境，使其發揮自身能夠催化分解PPi的能力，從而達到對PCR的增強效果。
[0019]由于上述技術方案的應用，與現有技術相比，本發明具有以下突出特點:
本發明所述技術方案中，采用了酶這一專一高效的催化劑，來分解PPi，傳統用高濃度酸性介質分解PPi與PCR堿性條件存在很大差異。
[0020]本發明所述技術方案中，采用了聚合物-蛋白質偶聯技術，有效提高蛋白質的最適反應溫度以及耐熱性。與從嗜