一種基因工程重組甲戊肝炎聯合疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于用基因工程制備疫苗的方法。
技術背景
[0002]在公共衛生中，甲型肝炎和戊型肝炎是一種主要的傳染性疾病，該疾病具有經糞一口傳播的相同途徑，以成年人尤其是老年人和孕婦作為相似的易感人群和疫苗受種人群。與甲型肝炎和戊型肝炎對應的甲肝病毒(HAV)和戊肝病毒(HEV)都是小RNA病毒，目前，兩種疾病都有單價疫苗。其中，甲肝疫苗主要是病毒滅活疫苗和減毒活疫苗，而戊肝疫苗是基因工程疫苗，抗原成分為原核表達的戊肝病毒0RF2 C端抗原表位。
[0003]Guu TS等采用的中和抗原位于0RF2 C端的P2結構域454_end是最重要的病毒中和位點，且在P2結構域上有3個取向朝外的、高度保守的環AA482 - 490，550 - 566，and 583 - 593，即與病毒-抗體結合有關(Guu TS, Liu Z, Ye Q, et al.Structure ofthe hepatitis E virus-like particle suggests mechanisms for virus assembly andreceptor binding.Proc Natl Acad Sci USA.2009.106(31): 12992-7.)。該基因工程表達的P2結構域可形成具有良好免疫原性的類病毒顆粒(Virus Like Particle，VLP)。聯合疫苗是疫苗研宄的發展方向，提供甲戊肝炎二者聯合疫苗的重要意義在于:聯合疫苗具有簡化免疫程序、減輕受種者精神和經濟負擔，降低漏種率，利于兩種疾病的預防與控制。傳統的聯合疫苗開發思路是將兩種現有疫苗進行聯用，急劇增高了疫苗成本，也無法解決兩種疫苗之間的配伍問題。
[0004]Gerardo等人的研宄表明，在HAV基因組的2A-2B連接區及5’非編碼區可以容納 600nt 以內的外源基因片段(Konduru K, Nakamura SM, Kaplan GG.Hepatitis
A virus (HAV) packaging size limit.Virol J.2009.6: 204.)，并能隨病毒復制，表達外源蛋白，該發現為開發以甲肝病毒為載體的重組聯合疫苗奠定了基礎。
[0005]董晨等人的研宄結果表明甲肝滅活疫苗能增強戊肝基因工程疫苗的免疫原
性(Dong C，Dai X, Meng JH.The first experimental study on a candidatecombined vaccine against hepatitis A and hepatitis E.Vaccine.2007.25(9):1662-8.)o我們的前期研宄發現甲戊嵌合抗原能形成類病毒顆粒(VLP)，有效誘導了抗HAV和 HEV 的中和抗體(Kui X, Sun M, Xie T, et al.The express1n, purificat1n,and immunogenicity of a new chimeric virus-like particle.Viral Tmmunol.2009.22(1): 49-56.)，這一研宄結果為開發甲戊重組疫苗奠定了堅實基礎。
【發明內容】
[0006]本發明旨在提供一種基因工程重組甲戊肝炎聯合疫苗的制備方法，該方法以攜帶戊肝抗原表位基因的重組甲肝病毒作為甲戊肝炎聯合疫苗的基礎，使戊肝抗原以基因的形式存在于甲肝病毒基因組中，并隨甲肝減毒株在體內的復制而表達，較好地配伍兩種不同疫苗。
[0007]同時，本發明不改變甲肝疫苗生產方法而生產甲戊肝炎聯合疫苗，生產成本低。
[0008]本發明上述目的通過以下制備方法實現，包括以下步驟:
(1)將HAV逆轉錄出全長CDNA插入在攜帶T7啟動子的轉錄載體上，并在
其2A-2B連接區的3C蛋白酶切位點后面按順序構建3甘氨酸肽鏈ggtggcgga、多克隆位點gtcgactacgtaactagt以及額外的3C蛋白酶切位點氨基酸肽鏈LFSQA編碼序列，該LFSQA編碼序列可以是3C蛋白酶切位點對應所有同義密碼子的任意組合，插入的輔助序列排列如下:
ggtggcgga gtcgactacgtaactagt ggtggaggc LFSQA 編碼序列；
(2)將HEV核心抗原0RF2基因插入HAV基因組的2A-2B連接區所構建的多克隆位點處，得到嵌合了 HEV 0RF2抗原表位基因的HAV全基因組轉錄載體；
(3)體外轉錄，產生重組HAVRNA:
a、使用限制性核酸內切酶在轉錄載體的HAV基因組下游線性化質粒模板；
b、使用體外轉錄試劑盒對線性化的模板進行轉錄，產生重組HAVRNA ;
(4)酚氯仿抽提純化體外轉錄的重組HAVRNA ；
(5)由脂質體介導重組HAVRNA轉染HAV易感細胞，拯救重組HAV病毒，進行擴增；
(6)重組HAV病毒鑒定。
[0009]所述的方法進一步是:步驟(I)所述的多克隆位點gtcgactacgtaactagt是在轉錄載體和HEV核心抗原編碼序列中不含有的限制性核酸內切酶位點的序列。
[0010]所述的方法進一步是:步驟(I)所述的額外的3C蛋白酶切位點氨基酸肽鏈LFSQA的最優選編碼序列是HAV基因組自有序列，該序列為ctgttttcacaagcc。
[0011]所述的方法進一步是:步驟(2) HEV核心抗原的優選序列為0RF2 aa 431-615。
[0012]所述的方法進一步是:步驟(5)由脂質體介導重組HAV RNA轉染HAV易感細胞拯救重組HAV病毒，包括:
無雙抗培養基培養至90%匯合率的HAV易感細胞細胞用DMEM洗2次；加入Opt1-MEM37°C孵育30分鐘；純化的RNA 8ug加入Opt1-MEM至250ul為溶液I ;Lip2000加入Opt1-MEM至250ul為溶液II ;將溶液I滴入溶液II混合為溶液III，室溫孵育5min ;將混合液III滴加入含Opt1-MEM的HAV易感細胞細胞，37°C孵育5_6小時；更換培養基為無雙抗的生長液；3天后更換生長液為維持液，每5天換液I次；4周后凍融超聲收獲重組HAV病毒。
[0013]所述的方法進一步是:步驟(5)其擴增是將拯救所得的重組HAV病毒與HAV病毒易感細胞37°C吸附2h后，補加維持液，再置于35°C培養28天收毒，期間每5_7天更換一次維持液。
[0014]所述的方法任意之一種是:由脂質體介導重組HAV RNA轉染的HAV易感細胞是Huh7 或 vero 或 KMB17 或 C0S-7 或 FRhK-4。
[0015]本發明具有的積極效果是:
當本發明重組的甲戊肝炎聯合的減毒活病毒進入人體后，隨著重組HAV在體內的復制，HEV開放讀碼框2—HEV 0RF2 aa 431-615基因也將得到表達。這是由于外源基因兩端為3C蛋白酶切位點，當3C蛋白酶對HAV結構多肽進行剪切加工的同時，也將HEV外源肽從2A-2B連接區釋放，該釋放使得甲肝病毒的裝配不受外源肽的影響。同時，釋放出的HEV抗原肽能在真核細胞中正確折疊，形成天然的構象表位肽。由于HEV外源肽以基因的形式存在于重組HAV病毒基因組中，隨重組HAV減毒株在體內的復制而表達，避免了兩種不同疫苗的配伍問題。本發明拯救出的重組病毒進行重組HAV病毒鑒定結果如圖2、3，其病毒滴度檢測符合《中國生物制品規程》(2000年版)甲型肝炎減毒活疫苗制造及檢定規程中的細胞培養法(CCID5tl)測定要求。
[0016]本發明在不改變甲肝疫苗生產方法的情況下即可生產甲戊肝炎聯合疫苗，較傳統的聯合疫苗，可顯著降低生產成本。
【附圖說明】
[0017]圖1是攜帶戊肝抗原基因的HAV體外轉錄產物。A為RNA分子量marker，B為重組 HAV RNA0
[0018]圖2是重組HAV 2A — 2B區的特異RT-PCR鑒定的特異條帶。A為DNA分子量marker, B為插入HEV 0RF2抗原基因的重組HAV病毒基因組2A-2B區特異性條帶，C為沒有插入HEV 0RF2抗原基因的HAV病毒2A-2B區特異性條帶。
[0019]圖3?8是HAV特異性免疫熒光。其中:圖3、4和5為重組HAV病毒感染的Huh7細胞同一視野下的不同成像。圖6、7和8為沒有感染HAV病毒的Huh7細胞對照在同一視野下的不同成像。
[0020]圖3為特異性抗HAV免疫熒光，一抗使用兔抗HAV特異性抗體，二抗使用紅色熒光標記的抗兔IgG，可見感染細胞胞漿有特異性熒光產生。
[0021]圖4為4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染。
[0022]圖5為圖3和4的疊加合成圖。
[0023]圖6為特異性抗HAV免疫熒光對照，一抗及二抗與圖3使用一致，可見對照細胞胞漿無特異性熒光產生。
[0024]圖7為4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)復染。
[0025]圖8為圖6和7的疊加合成圖。
[0026]圖9?14是HEV特異性免疫熒光。其中，圖9、10和11為重組HAV病毒感染的Huh7細胞同一視野下的不同成像；圖12、13和14為沒有感染HAV病毒的Huh7細胞對照在同一視野下的不同成像。
[0027]圖9為特異性抗HEV 0RF2免疫熒光，一抗使用兔抗HEV 0RF2特異性抗體，二抗使用紅色熒光標記的抗兔IgG，可見感染細胞胞漿有特異性熒光產生。
[0028]圖10 為 DAPI 復染。
[0029]圖11為圖9和10的疊加合成圖。
[0030]圖12為特異性抗HEV 0RF2免疫熒光對照，一抗