一對高特異性高親和力結合人肌紅蛋白的單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域。更具體地，涉及一對高特異性高親和力結合人肌紅蛋 白的單克隆抗體及其應用。
【背景技術】
[0002] -直以來，心血管疾病，特別是急性心肌梗塞（AMI)是嚴重影響人類健康的罪魁禍 首，一旦心肌梗塞發作，如果在短時間內得不到明確的診斷和有效的治療，人心肌就會因為 缺血缺氧而造成不可逆的壞死。因此，急性心肌梗塞早期及時正確的診斷對降低死亡率來 說顯得尤為重要。血清心肌損傷標志物的發現為急性心肌梗塞的診斷提供了重要的依據。
[0003] 利用心肌損傷標志物進行急性心肌梗塞的診斷已經有50多年的歷史，大致經歷 了三個重要的發展階段。在上個世紀的50至60年代，門冬氨酸氨基轉化酶（AST)、乳酸 脫氫酶（LDH)和肌酸激酶（CK)是急性心肌梗塞檢測的主要指標，隨后在70至80年代發 現了心臟特異性更高的肌酸激酶同功酶（CK-MB)，到了 90年代初期，肌紅蛋白、肌鈣蛋白 I (TnI)、肌鈣蛋白T (TnT)的發現與應用則成為了急性心肌梗塞診斷更特異、更敏感的檢測 指標。作為一種理想的心肌損傷標志物應該具備以下一些優點：（1)在心肌細胞內高濃度， 而在其他組織細胞中不存在或少量存在的物質；（2)在心肌細胞有輕微損傷時就能立刻釋 放入血，并能用目前的檢測手段檢測出來；（3)能夠檢測早期心肌損傷，并且窗口期較長；
[4] 能估計梗死范圍大小判斷預后，并能評估溶栓效果等。肌紅蛋白由于存在于心肌細胞 細胞質中，并且分子量小，是急性心肌梗塞發生后最早釋放到血液中的心肌損傷標志物，使 得疾病的及時診斷成為可能。另外由于其在血液中半衰期很短，所以是推測心梗面積和判 斷溶栓療效的重要指標。如果胸痛后8h，肌紅蛋白水平仍然處于正常值，那么可以排除AMI 的可能性，陰性排除率為100%。雖然由于其在骨骼肌中也大量存在，腎臟排泄功能異常的疾 病也可能引起肌紅蛋白含量的升高，其特異性并不是特別高，但是結合肌鈣蛋白、肌酸激酶 等其他特異性較高的指標則能顯著提高其診斷價值。因此，綜合考慮，肌紅蛋白是一個非常 好的急性心肌梗塞的診斷標志物。
[0004]目前，臨床上主要是采用以單克隆抗體為基礎的免疫學檢測方法來檢測肌紅蛋 白，這其中雙抗體夾心Elisa由于其靈敏度高、特異性強，適用于同時檢測多個樣本，并且 操作簡單，不需要特殊的儀器設備等優點而得到廣泛應用。目前國外已經成功開發出了能 用于檢測人肌紅蛋白的雙抗體夾心Elisa試劑盒，但是開發出能與進口試劑盒媲美的國產 試劑盒、打破國外產品的壟斷，仍然是國產試劑盒研發的努力方向。用于雙抗體夾心Elisa 的抗體除了具備高特異性、高親和力之外，還要能識別同一抗原的不同表位。另外兩株抗體 除了與免疫原有反應之外，還要能與樣本中的天然抗原起反應。因此，制備的單克隆抗體的 質量是成功研發雙抗體夾心Elisa試劑盒的關鍵。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是克服現有技術中肌紅蛋白檢測技術存在的缺陷和不 足，提供一對革G向人肌紅蛋白（Human Myoglobin)不同表位的鼠源性單克隆抗體，該對抗體 能高親和力、高特異性的結合人肌紅蛋白的不同表位，并形成雙抗體夾心模式，從而能夠對 肌紅蛋白進行定量檢測。
[0006] 本發明的目的是提供一對高特異性高親和力結合人肌紅蛋白的單克隆抗體。
[0007] 本發明另一目的是所述高特異性高親和力結合人肌紅蛋白的單克隆抗體的應用。
[0008] 本發明上述目的通過以下技術方案實現： 一種分泌高特異性高親和力結合人肌紅蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株3M4,于 2015年3月25日保藏于中國.武漢.武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號為 CCTCC C201529。
[0009] -種分泌高特異性高親和力結合人肌紅蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株5M7， 于2015年3月25日保藏于中國.武漢.武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏編號 為 CCTCC C201530。
[0010] 一對高特異性高親和力結合人肌紅蛋白的單克隆抗體3M4和5M7,分別由上述雜 交瘤細胞株3M4和雜交瘤細胞株5M7分泌得到。
[0011] 其中，所述單克隆抗體3M4和5M7的可變區基因均包括重鏈可變區基因和輕鏈可 變區基因；單克隆抗體3M4的重鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 1所示，輕鏈可變區的基 因序列如SEQ ID NO. 2所示；單克隆抗體5M7的重鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 3所 示，輕鏈可變區的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0012] 所述單克隆抗體3M4的重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示，輕鏈可變 區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示；所述單克隆抗體5M7的重鏈可變區的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 7所示，輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示。
[0013] 上述單克隆抗體3M4和5M7在檢測人血清中肌紅蛋白方面的應用，以及在制備檢 測人血清中肌紅蛋白的試劑或試劑盒方面的應用，均在本發明的保護范圍之內。
[0014] 一種檢測人血清中肌紅蛋白的雙抗體夾心ELISA方法，是以上述單克隆抗體3M4 作為檢測抗體，以單克隆抗體5M7作為捕獲抗體建立的。
[0015] 優選地，所述雙抗體夾心ELISA方法的步驟如下： 51. 用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液稀釋捕獲抗體5M7至包被濃度為2. 5 μ g/ml，4°C包被過 夜； 52. 用PBST洗滌3次后，采用5%脫脂奶粉或2% BSA進行封閉，封閉條件為37°C，Ih ; 53. 加入80 μ 1用樣本稀釋液兩倍稀釋的待檢測血清樣本，隨后加入120 μ I HRP標記 的檢測抗體3Μ4 (HRP標記的檢測抗體3Μ4用低交叉反應稀釋液稀釋至工作濃度0. 5 μ g/ ml)，37°C反應 Ih ; 54. 用PBST洗滌五次，每次3min，拍干后加入顯色液，室溫避光孵育IOmin后終止，酶 標儀讀取0D450值。
[0016] 其中，本發明實施例中所用的樣本稀釋液和低交叉反應稀釋液購自德國Candor Bioscience 公司。
[0017] 同時，以上述雙抗體夾心ELISA方法為基礎建立的檢測人血清中肌紅蛋白的試劑 盒也應在本發明的保護范圍之內。
[0018] 另外，對所得抗體的序列和結構分析可知，所述單克隆抗體3M4的重鏈可變區由 348個堿基組成，編碼116個氨基酸，可變區含有3個⑶R (互補決定簇)區。⑶Rl編碼6個 氨基酸，⑶R2編碼19個氨基酸，⑶R3編碼8個氨基酸(如附圖1所示)。可變區的框架區與 其他鼠源性抗體的同源性高達91. 8%，而3個CDR區則是特異性序列，與其他鼠源性抗體重 鏈可變區⑶R區有差異。
[0019] 所述單克隆抗體3M4的輕鏈可變區由309個堿基組成，編碼103個氨基酸，可變區 含有3個⑶R (互補決定簇）區。⑶Rl編碼12個氨基酸，⑶R2編碼7個氨基酸，⑶R3編碼 7個氨基酸(如附圖2所示)。可變區的框架區與其他鼠源性抗體的同源性為95. 7%，而3個 CDR區則為特異性序列，與其他鼠源性抗體輕鏈可變區CDR區有差異。
[0020] 所述單克隆抗體5M7的重鏈可變區由357個堿基組成，編碼119個氨基酸，可變區 含有3個⑶R (互補決定簇）區。⑶Rl編碼5個氨基酸，⑶R2編碼17個氨基酸，⑶R3編碼 16個氨基酸(如附圖3所示)。可變區的框架區與其他鼠源性抗體的同源性高達83. 3%，而 3個CDR區則是特異性序列，與其他鼠源性抗體重鏈可變區CDR區有差異。
[0021] 所述單克隆抗體5M7的輕鏈可變區由324個堿基組成，編碼108個氨基酸，可變區 含有3個⑶R (互補決定簇）區。⑶Rl編碼15個氨基酸，⑶R2編碼7個氨基酸，⑶R3編碼 6個氨基酸(如附圖4所示)。可變區的框架區與其他鼠源性抗體的同源性為92. 9%，而3個 CDR區則為特異性序列，與其他鼠源性抗體輕鏈可變區CDR區有差異。
[0022] 上述兩株抗人肌紅蛋白單克隆抗體蛋白的功能由抗體輕、重鏈可變區抗原互補決 定族（complementarity determing regions CDRs) CDR1、CDR2、CDR3 (是本發明的功能活 性區）中特異性核苷酸序列決定的，其相應的氨基酸序列構成了抗體特異性結合人肌紅蛋 白上的不同表位。
[0023] 本研宄通過大量的研宄和探索，得到了 13株能穩定分泌單克隆抗體的細胞株，其 中3M4和5M7這兩株高特異性、高親和力的抗體能形成配對，且5M7/HRP-3M4這個配對組 合有較高的靈敏度和較大的線性范圍；利用最佳配對組合5M7/HRP-3M4建立標準曲線，以 3M4作為檢測抗體，5M7作為捕獲抗體建立了雙抗體夾心Elisa方法，其線性范圍為25ng/ ml-1000ng/ml，優于進口試劑盒的線性范圍25ng/ml_500ng/ml。
[0024] 樣本檢測結果顯示，本發明的雙抗體夾心Elisa方法對人肌紅蛋白的陽性檢出率 為95% (19例/20例），陰性檢出率為100% (40例/40例），因此可以明確，本發明得到了 2 株高特異性