鮑曼不動桿菌1a1s_1969重組蛋白及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種鮑曼不動桿菌1A1S_1969蛋白及其制備方法 和應用。
【背景技術】
[0002] 鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii)為非發酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于 自然界的水及土壤、醫院環境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為條件致病菌。 感染的病人多是老年患者、危重疾病及機體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和 長期使用廣譜抗生素治療的患者。國內資料表明，鮑曼不動桿菌約占臨床分離的不動桿菌 的70%以上。鮑曼不動桿菌對第三代和第四代頭孢菌素的耐藥率已達63. 0%~89. 9%。 對四種氨基糖苷類（阿米卡星、慶大酶素、奈替米星、妥布霉素）和環丙沙星的耐藥率菌達 96. 3%。隨著鮑曼不動桿菌耐藥性的發展，且治療鮑曼不動桿菌引起的感染性疾病也變得 日益復雜，因此研發安全有效的預防性和治療性疫苗已經成為預防和治療鮑曼不動桿菌引 起的感染性疾病的重要趨勢。
[0003] 目前在國內外還沒有鮑曼不動桿菌進入臨床研宄，在疫苗的研發中優勢抗原的選 擇十分重要，傳統的全菌疫苗所含疫苗成分復雜，并且有一定的毒副作用，因此安全性不 高。目前國外一些學者對鮑曼不動桿菌外膜復合物疫苗進行了初步研宄，但是外膜復合物 成分復雜，同時含有大量的內毒素，對機體的毒副作用較大。因此研發一種質量可控，安全 有效的鮑曼不動桿菌疫苗是必然的趨勢。
[0004] 在以往的疫苗研發中細菌外膜蛋白是一種較好的候選抗原，細菌外膜含有豐富的 抗原，外膜抗原在早細菌感染初期具有粘附定植等作用，同時也能與機體產生相互作用，刺 激機體產生免疫反應。在Burkholderia multivorans疫苗研宄中，采用的外膜蛋白疫苗能 防止細菌早期的定植和感染；在腦膜炎奈瑟菌疫苗研宄中，外膜蛋白疫苗能激發機體產生 較高的血清抗體水平；同樣在Francisella tularensis疫苗研宄中證實膜外蛋白對哺乳 動物具有良好的保護性；同時在綠膿假單胞桿菌疫苗早期人體試驗中，顯示外膜蛋白就有 良好的安全性和免疫原性；以上研宄均證實了在革蘭氏陰性菌中，外膜蛋白含有多種抗原 可以激發機體產生抗體并與細菌表面抗原產生抗體中和作用，從而使外膜蛋白有望成為疫 苗候選抗原。
【發明內容】
[0005] 本發明提供一種鮑曼不動桿菌1A1S_1969重組蛋白及其制備方法和應用，該重組 蛋白表達量高，便于分離純化，高效安全，可以直接與佐劑配合使用，用于制備抗鮑曼不動 桿菌感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。
[0006] 本發明利用反向疫苗學篩選出一種外膜蛋白，A1S_1969蛋白是存在于鮑曼不動桿 菌細胞壁上的一種蛋白，結構和功能未知。編碼A1S_1969的基因表達出855個氨基酸的序 列，通過信號肽分析，該蛋白含43個氨基酸的信號肽序列，如圖5所示。通過三維結構預測， 該成熟蛋白（44-855)可以分為主要含alpha螺旋部分（44-414)及主要含beta折疊部分 (415-855)，如圖6所示。因此，本發明利用基因工程技術分別構建表達表達這兩部分，得到 的重組蛋白分別被命名為1A1S_1969及2A1S_1969。
[0007] 鑒于A1S_1969蛋白含有一個信號肽，本發明截去A1S_1969(SEQ ID NO. 3)氨基 端1~45位氨基酸后并選取A1S_1969的第46~414位氨基酸序列（SEQ ID NO. 1)和第 415~855位氨基酸（SEQ ID NO. 7,其DNA序列如SEQ ID NO. 8所示）分別利用SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 8作模板進行克隆、表達和酶切，優選地，獲得1A1S_1969重組蛋白（SEQ ID NO. 5)，再進行免疫保護性的評價。
[0008] 本發明優選1A1S_1969重組蛋白，其制備時質量可控，純化工藝簡單快捷。該重組 蛋白在抵抗鮑曼不動桿菌致死性感染中有較高的免疫保護性，可用作制備抗鮑曼不動桿菌 感染的亞單位疫苗以及相關的檢測試劑盒。
[0009] 本發明的技術方案具體如下：
[0010] 1A1S_1969的重組蛋白，包含A1S_1969的第46-414位氨基酸序列的成熟肽，該重 組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0011] 所述成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 不O
[0012] 所述重組蛋白通過標簽蛋白GST融合表達，所述標簽蛋白融合于所述1A1S_1969 蛋白的N端。
[0013] 該重組蛋白由融合表達并酶切后在成熟肽的氨基端加入GPLGS五個氨基酸形成。
[0014] 編碼1A1S_1969重組蛋白的多核苷酸。
[0015] 所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 6所示或緊密結合在其 的一端或兩端添加或缺失若干個核苷酸得到的編碼與SEQ ID NO. 5所示蛋白具有相同或相 似功能的重組蛋白的序列。
[0016] A1S_1969重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0017] 1)根據編碼1A1S_1969蛋白的核酸序列設計正向引物P1A1S1969B1(SEQ ID NO. 9)和反向引物P1A1S1969N2(SEQ ID NO. 10);根據編碼2A1S_1969蛋白的核酸序列設計 正向引物 P2A1S1969B1(SEQ ID NO. 11)和反向引物 P2A1S1969N2(SEQ ID NO. 12);
[0018] 2)使用步驟1設計的正向引物和反向引物，通過PCR擴增出編碼1A1S_1969蛋白 及2A1S_1969的基因片段；
[0019] 3)步驟2)所得的基因片段克隆至表達載體，然后轉化至宿主菌；
[0020] 4)誘導轉化后的宿主菌表達1A1S_1969重組蛋白和2A1S_1969融合蛋白；
[0021] 5)純化重組蛋白。
[0022] 表達載體或宿主細胞，包含編碼1A1S_1969重組蛋白的多核苷酸或宿主細胞。
[0023] 所述載體是pGEX-6P-2表達載體；所述宿主細胞是大腸桿菌，所述大腸桿菌是 XLl-Blue0
[0024] 抗1A1S_1969蛋白的抗體。
[0025] 1A1S_1969蛋白在制備預防或治療鮑曼不動桿菌感染的藥物中的應用。
[0026] 1A1S_1969蛋白在制備鮑曼不動桿菌檢測試劑盒中的應用。
[0027] 本發明所述1A1S_1969蛋白，主要包含SEQ ID NO. 1的氨基酸，由于融合表達并酶 切后在氨基端加入GPLGS五個氨基酸形成如SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列。
[0028] 本發明用于表達1A1S_1969蛋白的重組表達載體，其包含編碼所述1A1S_1969蛋 白的DNA序列以及載體序列。
[0029] 所述編碼1A1S_1969蛋白的DNA序列可以是SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 6,或在緊 密結合它們的的一端或兩端添加或缺失若干個核苷酸后得到的編碼與SEQ ID NO. 5所示蛋 白具有相同或相似功能蛋白的序列。
[0030] 本發明優選采用PGEX-6P-2質粒來構建重組表達載體，表達1A1S_1969融合蛋白， 其主要特點是所表達的融合蛋白中的氨基端接有一個26kDa的GST標簽，該標簽可作為蛋 白純化標記。與其他融合載體相比，PGEX系列載體具有純化條件溫和、步驟簡單、不需要變 性劑的加入，從而使純化后的蛋白能最大限度保持其空間構象和免疫原性。
[0031] 本發明采用基因工程技術克隆表達此保護性抗原1A1S_1969重組蛋白，表達量 高，便于分離純化，而且高效安全。1A1S_1969重組蛋白可以直接與佐劑（如Al (OH)3佐劑、 AlPO4佐劑、MF59、AS0 3、AS04、不完全弗氏佐劑、完全弗氏佐劑、等）配合使用，優選AlPO4K 劑用于肌肉注射免疫。
[0032] 本發明的基因工程重組蛋白的表達方法具有以下6個優點：
[0033] 1、A1S_1969蛋白及1A1S_1969蛋白均未用于重組亞單位疫苗領域；
[0034] 2、1A1S_1969蛋白的表達質粒在原核表達系統（大腸桿菌）中誘導表達，表達量 高，質量安全可控；
[0035] 3、選擇pGEX-6p-2表達載體，1A1S_1969重組蛋白以融合蛋白形式表達，最大限度 保持了其原有的空間構象；
[0036] 4、所表達的融合蛋白中就含有個GST標簽，此標簽就成為蛋白純化的標記，使 得純化條件溫和、步驟簡單、不需要變性劑的加入，從而純化后的蛋白能最大限度保持其空 間構象和免疫原性；
[0037] 5、1A1S_1969融合蛋白表達率約為30%，純化后的1A1S_1969融合蛋白純度大于 95% ；
[0038] 6、1A1S_1969融合蛋白能夠誘導動物產生特異性的抗體。
[0039] 利用本發明1A1S_1969融合蛋白制備的亞單位疫苗可通過皮下（肌肉）注射途徑 進行免疫接種，激發機體產生IgG抗體和細胞免疫應答。并經動物實驗證實，所述基因工程 重組單價亞單位疫苗具有良好的抗鮑曼不動桿菌感染的免疫保護效果。為進一步的聯合疫 苗和多亞單位融合疫苗研宄打下基礎，同時為防治疫苗和診斷試劑盒的研制及應用具有重 要的作用。
[0040] 為了使本發明目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖及實施例，對本 發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用 于限定本發明。
【附圖說明】
[0041] 圖1是1A1S_1969基因片段的PCR擴增結果，其中，泳道M :核酸（DNA)分子量標 準（Marker);泳道I :1A1S_1969基基因片段（1107bp)的PC