蛋白質純化的制作方法
【專利說明】蛋白質純化 發明領域
[0001] 本發明一般性地設及純的且穩定的NY-ES0-1相關多膚W及生產它的方法。
[000引發明背景 被稱為癌癥-睪丸抗原（CT抗原）的、僅在腫瘤細胞和免疫赦免組織中一般性表達的 一類蛋白的基因調控，在癌癥患者中受到破碎。該導致該些抗原在多種腫瘤中異常表達。癌 癥患者中一些CT抗原的免疫原性使它們成為癌癥疫苗開發的理想祀標。目前感興趣的用 于癌癥免疫治療的癌癥睪丸抗原是NY-ES0-1。還鑒別了另一個癌癥睪丸抗原，LAGE-1。已 描述了兩個LAGE-1轉錄物，LAGE-la和LAGE化。LAGE-化被不完全剪接，并且編碼推定的 大約210個氨基酸殘基的蛋白質（Sunetal. (2006)Cancer/備w?(97 /備unWAer, 6: 55: 644-652)0
[0003]LAGE-1和NY-ESO-1蛋白的N末端區域是高度保守的，并被認為具有超過97%的 同一性。但是，LAGE-1與NY-ES0-1的區別在于其中間區域只有62%相同。NY-ES0-1和 LAGE-la的C末端是高度保守的（超過97%的同一性）。但是，LAGE-化的C末端較長并且 不保守，并被認為與LAGE-la/NY-ESO-1的相同區域的同一性小于50%。關于該些蛋白質的 一般信息可W在LICR網站（參見WWW.cancerimmunity.org/CTdat油ase)上找到。
[0004] 重組CT抗原的純化是制造基于CT抗原的癌癥免疫治療劑的一個步驟。已研究 了各種方法W從重組產生的蛋白質中除去污染物如宿主細胞蛋白，并且有市售的試劑盒幫 助開發從宿主細胞如大腸桿菌表達系統生產可溶性和活性重組蛋白的方法。參見，例如， "ToolsforEnhancingSolubilityofProteinsExpressedinE. coliandrefolding screensforDifficultTargets，copyright2008EMDChemicalsInc.，anaffiliate ofMerckKGaA,Damstadt,Germany。盡管如此，在某些情況下，在獲得足夠純度水平的CT 抗原上遇到困難。
[0005] 例如，已證明難臥用標準的基于大腸桿菌的重組表達系統產生重組NY-ES0-1。參 見Mu:rphy(2005)化邸.做ocAc化做35:119-134。這種純化方案涉及多個 色譜步驟，伴隨著NY-ES0-1蛋白的大量喪失。此外，所獲得的低純度水平引起了對根據 已公開的純化方法純化的重組NY-ES0-1的免疫治療用途的關注，因為可能有污染的大腸 桿菌蛋白引起遲發型超敏反應。在解決該些問題上的努力導致使用被突變W兼容替代的 表達系統如酵母的重組NY-ES0-1變體。參見Piatesi(2006)化Wei/7反r/Tressio/?ant/ Purification 232-2A2。
[000引發明簡述 本文提供NY-ESO-1相關多膚的純化方法，W及用該些方法產生的多膚。還提供包含純 的且穩定的NY-ES0-1的組合物。
[0007] 在一些實施方案中，提供純化具有親和標簽的NY-ES0-1相關多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；和化）通過固定化金屬親和色譜（IMAC)純化所述混合物，W獲得 具有親和標簽的純的多膚。
[0008] 在一些實施方案中，合適的緩沖液包含20mlTrispH8. 0、5%N-月桂酷肌氨酸、 20ml咪挫、和5mlTCEP。在一些實施方案中，組合物是細胞團塊。在一些實施方案中，親 和標簽是金屬離子結合親和標簽。在一些實施方案中，親和標簽是his標簽。
[0009] 在一些實施方案中提供純化具有親和標簽的NY-ES0-1相關多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；(b)通過IMAC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣 在IMAC基質上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質；（iii)用包 含脈、化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液 洗脫具有親和標簽的多膚，W獲得具有親和標簽的純的多膚。
[0010] 在一些實施方案中，IMAC基質是Ni"。在一些實施方案中，IMAC基質包含在柱中。 在一些實施方案中，第一緩沖液包含20ml化ispH8、1%N-月桂酷肌氨酸、和1mlTCEP。 在一些實施方案中，第二緩沖液包含20mlTrispH7、8M脈、0.5M化Cl、lmlTCEP、和 20ml咪挫。在一些實施方案中，洗脫緩沖液包含20mlTrispH7、8M脈、0.5M化Cl、l mlTCEP、和 500ml咪挫。
[0011] 在一些實施方案中，提供純化具有親和標簽的NY-ESO-1相關多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；(b)通過IMAC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣 在IMAC基質上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質；（iii)用包 含脈、化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液 洗脫具有親和標簽的多膚；（e)將具有親和標簽的多膚進行緩沖液交換獲得具有親和標簽 的純的多膚。
[0012] 在一些實施方案中，通過在葡聚糖G-25柱上使用色譜進行緩沖液交換步驟。在一 些實施方案中，使用包含10ml己酸鋼pH5的緩沖液進行緩沖液交換。
[0013] 在一些實施方案中，提供純化具有親和標簽的NY-ES0-1相關多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；(b)通過IMAC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣 在IMAC基質上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質；（iii)用包 含脈、化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液 洗脫具有親和標簽的多膚；（C)將具有親和標簽的多膚進行緩沖液交換獲得包含具有親和 標簽的多膚的洗脫液；W及（d)濃縮并滲濾具有親和標簽的多膚，W獲得具有親和標簽的 純的多膚。
[0014] 在一些實施方案中，通過切向流動過濾（TF巧進行濃縮和滲濾步驟。在一些實施 方案中，在緩沖液中的10kDa再生纖維素C-screen膜上進行濃縮和滲濾。在一些實施方 案中，在包含10ml己酸鋼pH5的緩沖液中進行濃縮和滲濾。
[0015] 在一些實施方案中，提供純化具有親和標簽的NY-ES0-1相關多膚的方法，包括W 下步驟（a)在包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標簽的多膚的 組合物，W獲得混合物；化）使該混合物澄清；（C)通過IMAC純化混合物，其包含W下子步 驟（i)將混合物加樣在IMAC基質上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液 洗漆基質；（iU)用包含脈、化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質；（iv)用包含脈、化C1、 和TCEP的洗脫緩沖液洗脫具有親和標簽的多膚；（d)將具有親和標簽的多膚進行緩沖液 交換獲得包含具有親和標簽的多膚的洗脫液；W及（e)濃縮并滲濾具有親和標簽的多膚， W獲得具有親和標簽的純的多膚。
[0016] 在一些實施方案中，澄清步驟進一步包括離屯、混合物。在一些實施方案中，澄清步 驟進一步包括混合物的過濾。在一些實施方案中，澄清步驟進一步包括離屯、混合物和混合 物的過濾二者。在一些實施方案中，離屯、步驟W15, 900Xg進行。在一些實施方案中，過 濾步驟使用0. 45/0. 22umPES濾器進行。
[0017] 在一些實施方案中，提供純化具有親和標簽的NY-ES0-1相關多膚的方法，包括W 下步驟（a)破碎包含具有親和標簽的多膚的細胞，W獲得組合物；化）在包含N-月桂酷 肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標簽的多膚的組合物，W獲得混合物；(C)使 該混合物澄清；（d)通過IMC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣在IMC 基質上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質；（iii)用包含脈、 化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液洗脫具 有親和標簽的多膚；（e)將具有親和標簽的多膚進行緩沖液交換獲得包含具有親和標簽的 多膚的洗脫液；W及（f)濃縮并滲濾具有親和標簽的多膚，W獲得具有親和標簽的純的多 膚。
[0018] 在一些實施方案中，提供純化具有親和標簽的NY-ES0-1相關多膚的方法，包括W 下步驟（a)破碎包含具有親和標簽的多膚的細胞，W獲得組合物；化）在包含N-月桂酷 肌氨酸和TCEP的緩沖液中溶解包含具有親和標簽的多膚的組合物，W獲得混合物；(C)使 該混合物澄清；（d)通過IMC純化混合物，其包含W下子步驟（i)將混合物加樣在IMC 基質上；（ii)用包含N-月桂酷肌氨酸和TCEP的第一緩沖液洗漆基質；（iii)用包含脈、 化C1、和TCEP的第二緩沖液洗漆基質；（iv)用包含脈、化C1、和TCEP的洗脫緩沖液洗脫具 有親和標簽的多膚；（e)將具有親和標簽的多膚進行緩沖液交換獲得包含具有親和標簽的 多膚的洗脫液；W及（f)濃縮并滲濾具有親和標簽的多膚；和（g)使具有親和標簽的多膚 過濾，W獲得具有親和標簽的純的多膚。
[001引在一些實施方案中，過濾是無菌過濾。在一些實施方案中，在0.45/0. 2Sartobran? 300己酸纖維素囊包上進行過濾。
[0020] 在一些實施方案中，提供純化具有his標簽的NY-ES0-1相關多膚的方法，包括W 下步驟（a)通過W下子步驟破碎包含具有his標簽的多膚的細胞，所述子步驟包括（i) 使細胞懸浮于包含50mlTrispH8、150ml化Cl、和10ml邸TA的緩沖液中；（ii)應用 細胞破碎技術，例如高壓均質機、弗氏壓碎器、或滲透壓沖擊；（iii)W15, 900X g離屯、細 胞，W獲得沉淀；（iv)在包含50mlTris抑8和150ml化C1的緩沖液中洗漆