一種單純皰疹病毒實時熒光定量pcr試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的PCR (Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應(yīng)） 試劑盒，尤其涉及一種單純皰瘆病毒實時熒光定量PCR試劑盒。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004] 單純皰疼病毒（herpes simplex virus，HSV)是屬于皰疼病毒科a病毒亞科的線 性雙鏈DNA病毒。HSV能引起人類多種疾病，如齦口炎（gingivostomatitis)、角膜結(jié)膜炎 (keratoconjunctivitis)、腦炎（encephalitis)以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。在感 染宿主后，常在神經(jīng)細(xì)胞中建立潛伏感染，激活后又會出現(xiàn)無癥狀的排毒，在人群中維持傳 播鏈，周而復(fù)始地循環(huán)。根據(jù)抗原性的差別目前把該病毒分為1型和2型。1型主要由口唇 病灶獲得，2型可從生殖器病灶分離到。人群被病毒感染發(fā)生后四個月到數(shù)年被感染的人數(shù) 可達(dá)人口總數(shù)的50-90%，是最易侵犯人的一種病毒，但在臨床僅有一部份發(fā)病。此病可分 為口唇性皰瘆、皰瘆性角膜炎、皰瘆性皮膚炎、陰部皰瘆和卡波西病等。
[0005] 當(dāng)前，病毒的分離培養(yǎng)是當(dāng)今臨床上診斷皰瘆病毒感染的可靠依據(jù)?？刹杉つw、 腦脊液、角膜刮取物、唾液等標(biāo)本，接種人二倍體成纖維細(xì)胞株WI38及其它傳代細(xì)胞株如 Vero、BHK等，經(jīng)24~48小時后，細(xì)胞則出現(xiàn)腫脹、變圓、細(xì)胞融合等病變。然后用HSV-1和 HSV-2的單克隆抗體作免疫熒光染色鑒定或應(yīng)用DNA限制性內(nèi)切酶圖譜分析來定型。常用 于抗體檢測的方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗、中和試驗、免疫熒光及酶聯(lián)免疫吸附試驗等，臨床多用 于急性感染診斷和器官移植患者的檢測，以及流行性病學(xué)調(diào)查。如用于急性感染診斷，應(yīng)采 取急性期和恢復(fù)期雙份血清，同時檢測血清中的IgG和IgM。上述兩種方法對HSV的檢測在 一定程度上是有效的；但是它們也有不足的地方：如病毒的分離培養(yǎng)，是需要耗費大量的 人力、物力和時間；抗原抗體檢測對一些臨床樣本缺乏足夠的靈敏度，有時不能判定出一些 正常個體中HSV的潛伏感染。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足，提供一種單純皰瘆病毒實 時熒光定量PCR試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的： 1、單純皰瘆病毒實時熒光定量PCR試劑盒(簡稱試劑盒） 本試劑盒是在對單純皰瘆病毒核酸序列分析的基礎(chǔ)上，選取保守基因序列設(shè)計出一對 特異性引物和一條特異性的熒光探針，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對單純皰瘆病毒進(jìn)行檢 測。此技術(shù)不僅縮短了操作時間，減少了污染，也降低了樣品診斷的成本，具有潛在的應(yīng)用 價值。
[0009] 在按下述方法設(shè)計的引物和探針存在下，在熒光定量PCR儀中，對病毒核酸進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，來實現(xiàn)對單純皰瘆病毒的檢測。
[0010] 具體地說，本試劑盒包括單純皰瘆病毒的一對特異性引物（F和R)、一條特異性熒 光探針（FP)、陽性對照、陰性對照、5 XPCR Buffer和Enzyme Mix; ① 單純皰瘆病毒的一對特異性引物（F和R) F :5'-ACTCGAGTGCGAAAAGACGTTCT-3' 23bp R:5'-GTATCGTCGTAAAACAGCAGGTC-3' 23bp ； ② 單純皰瘆病毒的一條特異性熒光探針（FP) FP ：FAM-AAAGGGCGTGGATCTGGTGCGT-MGB-1 22bp, 熒光探針5'端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)FAM，3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)MGB ; ③ 陽性對照 單純皰瘆病毒標(biāo)準(zhǔn)品； ④ 陰性對照 RNase Free H20； ⑤ 5XPCR Buffer 配制： Tris ? Cl 20mM KC1 80mM (NH4)2S04 80mM DTT 1. 5mM MgCl2 12mM dNTP lOmM， 配置混合后于冰箱_20°C保存； ⑥ Enzyme Mix 配制： Tris ? Cl 20mM KC1 80mM DTT ImM EDTA 0.1 mM Nonidet P-40 0. 5% Tween 20 0.5% 甘油 50% Taq 酶 2.5U/ul， 配置混合后于冰箱_20°C保存。
[0011] 2、本試劑盒的使用方法 ①病毒核酸的提取 A、 首先在緩沖液1、2中加入無水乙醇，分別加入25ml和30ml無水乙醇； 在漂洗液中加入30 μg/ml carrier RNA; B、 取30 y 1蛋白酶放入1. 5ml離心管中； C、 將標(biāo)本(如痰液等）取200 y 1加入此管中，充分混勻； D、 再在每管分別加入200y1漂洗液(含30yg/mlcarrierRNA)，混勻振蕩30s，70°C 溫育lOmin; E、 加入250y1無水乙醇，充分混勻振蕩30s，室溫裂解5min; F、 將上述裂解液加入離心柱中，8000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液。濾柱仍放回 收集管上，將步驟③剩余的混合液全部吸入濾柱中，離心后棄離心液； G、 濾柱中加入500y1緩沖液1，12000rpm，離心lmin，棄收集管中的離心液； H、 另取一支干凈的2ml收集管，將離心后的濾柱移到新的收集管上，于濾柱中加入 500y1緩沖液2,12000rpm，離心lmin，重復(fù)步驟⑧一次； I、 將濾柱移到一個干凈的收集管中，12000rpm，離心3min，后將濾柱放在37°C15min 以干燥濾膜； J、 將濾柱放在1. 5mlEppendorf管上，向濾柱中加入50ulRNase_freeH20,室溫靜置 2min。12OOOrpm，離心2min，收集離心液即為提取的核酸。
[0012] ②實時熒光定量PCR擴(kuò)增(每份25ul體系） 取5ul病毒核酸作為模板，同時加入20ul實時熒光定量PCR反應(yīng)液至八聯(lián)管中進(jìn)行熒 光定量PCR擴(kuò)增。
[0013]A、實時熒光定量PCR反應(yīng)液(mix)的配制： 5xPCR buffer 8ul Enzyme Mix 5ul 特異性引物F/R 各lul 特異性熒光探針FP 2ul Rnase Free H20 3ul 反應(yīng)液體積： 20ul B、一步實時熒光定量PCR反應(yīng)程序： X 50 °C30min 1 95 °C5min S 94°C15s 1' 58°C30s ：S Goto3 ,45 cycles 步驟s設(shè)為熒光檢測模式c、檢測儀器 本發(fā)明使用LightCycle 480II熒光定量PCR儀，在FAM通道進(jìn)行檢測。
[0014] D、結(jié)果判斷 在熒光定量PCR儀運轉(zhuǎn)正常，陰性對照和陽性對照均正常的情況下， (1) 當(dāng)Ct彡35時，判斷樣品為HSV陽性； (2) 當(dāng)35〈Ct< 40時，重復(fù)一次實驗，如果Ct還是在此范圍之內(nèi)或小于35就判斷樣品 為HSV陽性，否則判斷樣品為HSV陰性。
[0015] (3 )當(dāng)Ct>40時，判斷樣品為HSV陰性。
[0016] 本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果： ① 檢測時間周期短、檢測效率高； ② 檢測病毒特異性高，準(zhǔn)確率