用于檢測玉米植物dbn9927的核酸序列及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于檢測玉米植物DBN9927的核酸序列及其檢測方法，特別是涉 及一種對昆蟲具有抗性且耐受草甘膦除草劑施用的轉基因玉米事件DBN9927和用于檢測 生物樣品中是否包含特定轉基因玉米事件DBN9927的核酸序列及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 玉米（Zea mays L.)在世界上很多地區都是主要的糧食作物。生物技術已經應用 于玉米以改善其農藝性狀和品質。在玉米生產中昆蟲抗性是一項重要的農藝性狀，特別是 對鱗翅目昆蟲的抗性，例如玉米螟、棉鈴蟲、黏蟲等。玉米對鱗翅目昆蟲的抗性可以通過轉 基因的方法使鱗翅目昆蟲的抗性基因在玉米植物中表達而獲得。另一個重要的農藝性狀是 除草劑耐受性，特別是耐受草甘膦除草劑。玉米對草甘膦除草劑的耐受性可以通過轉基因 的方法使草甘膦除草劑耐受型基因（如EPSPS)在玉米植物中表達而獲得。
[0003] 已知外源基因在植物體內的表達受到它們的染色體位置的影響，可能是由于染色 質結構（如異染色質）或轉錄調節元件（如增強子）接近整合位點。為此，通常需要篩選大 量的事件才有可能鑒定出可以商業化的事件（即導入的目標基因得到最優表達的事件）。 例如，在植物和其他生物體中已經觀察到導入基因的表達量在事件間可能有很大差異；在 表達的空間或時間模式上可能也存在差異，如在不同植物組織之間轉基因的相對表達存在 差異，這種差異表現在實際的表達模式可能與根據導入的基因構建體中的轉錄調節元件所 預期的表達模式不一致。因此，通常需要產生成百上千個不同的事件并從這些事件中篩選 出具有以商業化為目的所預期的轉基因表達量和表達模式的單一事件。具有預期的轉基因 表達量和表達模式的事件可用于采用常規育種方法通過有性異型雜交將轉基因滲入到其 他遺傳背景中。通過這種雜交方式產生的后代保持了原始轉化體的轉基因表達特征。應用 這種策略模式可以確保在許多品種中具有可靠的基因表達，而這些品種能很好的適應當地 的生長條件。
[0004] 能夠檢測特定事件的存在以確定有性雜交的后代是否包含目的基因將是有益的。 此外，檢測特定事件的方法還將有助于遵守相關法規，例如來源于重組農作物的食物在投 入市場前需要獲得正式批準和進行標記。通過任何熟知的多核苷酸檢測方法來檢測轉基因 的存在都是可能的，例如聚合酶鏈式反應（PCR)或利用多核苷酸探針的DNA雜交。這些檢 測方法通常集中于常用的遺傳元件，例如啟動子、終止子、標記基因等。因此，除非與插入的 轉基因DNA相鄰的染色體DNA( "側翼DNA"）的序列是己知的，上述這種方法就不能夠用于 區別不同的事件，特別是那些用相同的DNA構建體產生的事件。所以，目前常利用跨越了插 入的轉基因和側翼DNA的接合部位的一對引物通過PCR來鑒定轉基因特定事件，具體地說 是包含于側翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種用于檢測玉米植物DBN9927的核酸序列及其檢測方法， 轉基因玉米事件DBN9927對昆蟲具有較好的抗性并對草甘膦除草劑具有較好的耐受性，且 檢測方法可以準確快速的鑒定生物樣品中是否包含特定轉基因玉米事件DBN9927的DNA分 子。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供了一種核酸序列，SEQ ID N0:3或其互補序列中至少 11個連續的核苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互補序列中至少11個連續的核苷酸。
[0007] 優選地，所述核酸序列包括SEQ ID NO: 1或其互補序列、和/或SEQ ID N0:2或其 互補序列。
[0008] 進一步地，所述核酸序列包括SEQIDN0:3或其互補序列、和/或SEQIDN0:4或 其互補序列。
[0009] 更進一步地，所述核酸序列包括SEQIDN0:5或其互補序列。
[0010] 所述SEQ ID NO: 1或其互補序列為轉基因玉米事件DBN9927中在插入序列的5' 末端位于插入接合部位附近的一個長度為22個核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:1或其互補 序列跨越了玉米插入位點的側翼基因組DNA序列和插入序列的5'末端的DNA序列，包含所 述SEQ ID N0:1或其互補序列即可鑒定為轉基因玉米事件DBN9927的存在。所述SEQ ID N0:2或其互補序列為轉基因玉米事件DBN9927中在插入序列的3'末端位于插入接合部位 附近的一個長度為22個核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:2或其互補序列跨越了插入序列的 3'末端的DNA序列和玉米插入位點的側翼基因組DNA序列，包含所述SEQ ID N0:2或其互 補序列即可鑒定為轉基因玉米事件DBN9927的存在。
[0011] 本發明中，所述核酸序列可以為所述SEQ ID N0:3或其互補序列中轉基因插入序 列的任何部分的至少11個或更多個連續多核苷酸（第一核酸序列），或者為所述SEQ ID NO: 3或其互補序列中5'側翼玉米基因組DNA區域的任何部分的至少11個或更多個連續 多核苷酸（第二核酸序列）。所述核酸序列進一步可以為同源于或互補于包含完整的所述 SEQ ID NO: 1的所述SEQ ID N0:3的一部分。當第一核酸序列和第二核酸序列一起使用時， 這些核酸序列在產生擴增產物的DNA擴增方法中包括DNA引物組。使用DNA引物對在DNA 擴增方法中產生的擴增產物是包括SEQ ID NO: 1的擴增產物時，可以診斷轉基因玉米事件 DBN9927或其后代的存在。本領域技術人員熟知的，第一和第二核酸序列不必僅僅由DNA組 成，也可包括RNA、DNA和RNA的混合物，或者DNA、RNA或其它不作為一種或多種聚合酶模板 的核苷酸或其類似物的組合。此外，本發明中所述探針或引物應該是至少大約11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21或22個連續核苷酸的長度，其可以選自5￡〇10勵：1、5￡〇10 N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5 中所述的核苷酸。當選自 SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5所示的核苷酸時，所述探針和引物可以為長度是至少大約21 個到大約50個或更多的連續核苷酸。所述SEQ ID N0:3或其互補序列為轉基因玉米事件 DBN9927中在插入序列的5'末端位于插入接合部位附近的一個長度為1178個核苷酸的序 列，所述SEQ ID N0:3或其互補序列由1048個核苷酸的玉米側翼基因組DNA序列（SEQ ID NO: 3的核苷酸1-1048)、77個核苷酸的DBN10124構建體DNA序列（SEQ ID NO: 3的核苷酸 1049-1125)和53個核苷酸的tNos (胭脂堿合成酶）轉錄終止子的3'末端DNA序列（SEQ ID N0:3的核苷酸1126-1178)組成，包含所述SEQ ID N0:3或其互補序列即可鑒定為轉基 因玉米事件DBN9927的存在。
[0012] 所述核酸序列可以為所述SEQIDN0:4或其互補序列中轉基因插入序列的任何部 分的至少11個或更多個連續多核苷酸（第三核酸序列），或者為所述SEQ ID NO: 4或其互 補序列中3'側翼玉米基因組DNA區域的任何部分的至少11個或更多個連續多核苷酸（第 四核酸序列）。所述核酸序列進一步可以為同源于或互補于包含完整的所述SEQ ID N0:2 的所述SEQ ID N0:4的一部分。當第三核酸序列和第四核酸序列一起使用時，這些核酸序 列在產生擴增產物的DNA擴增方法中包括DNA引物組。使用DNA引物對在DNA擴增方法中 產生的擴增產物是包括SEQ ID N0:2的擴增產物時，可以診斷轉基因玉米事件DBN9927或 其后代的存在。所述SEQ ID N0:4或其互補序列為轉基因玉米事件DBN9927中在插入序列 的3'末端位于插入接合部位附近的一個長度為1574個核苷酸的序列，所述SEQ ID N0:4或 其互補序列由38個核苷酸的t35S轉錄終止子序列（SEQ ID NO:4的核苷酸1-38)、152個 核苷酸的DBN10124構建體DNA序列（SEQ ID N0:4的核苷酸39-190)和1384個核苷酸的 玉米整合位點側翼基因組DNA序列（SEQ ID N0:4的核苷酸191-1574)組成，包含所述SEQ ID N0:4或其互補序列即可鑒定為轉基因玉米事件DBN9927的存在。
[0013] 所述SEQIDN0:5或其互補序列為表征轉基因玉米事件DBN9927的長度為9801 個核苷酸的序列，其具體包含的基因組和遺傳元件如表1所示。包含所述SEQIDN0:5或 其互補序列即可鑒定為轉基因玉米事件DBN9927的存在。
[0014] 表1、SEQ ID N0:5包含的基因組及遺傳元件
[0015]
【主權項】
1. 一種核酸序列，其特征在于，包括SEQ ID N0:3或其互補序列中至少11個連續的核 苷酸、和/或SEQ ID N0:4或其互補序列中至少11個連續的核苷酸。
2. 根據權利要求1所述核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:1或其互 補序列、和/或SEQ ID N0:2或其互補序列。
3. 根據權利要求2所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:3或其 互補序列、和/或SEQ ID N0:4或其互補序列。
4. 根據權利要求3所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列包括SEQ ID N0:5或其 互補序列。
5. -種檢測樣品中轉基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待檢測樣品與至少兩種引物在核酸擴增反應中接觸； 進行核酸擴增反應； 檢測擴增產物的存在； 所述擴增產物包括SEQ ID NO:3或其互補序列中至少11個連續的核苷酸、或者SEQ ID NO:4或其互補序列中至少11個連續的核苷酸。
6. 根據權利要求5所述檢測樣品中轉基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其特 征在于，所述擴增產物包括SEQ ID NO: 1或其互補序列中第1-11位或第12-22位連續核苷 酸、或者SEQ ID NO:2或其互補序列中第1-11位或第12-22位連續核苷酸。
7. 根據權利要求5或6所述檢測樣品中轉基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法， 其特征在于，所述擴增產物包括SEQ ID NO: 1或其互補序列、SEQ ID NO:2或其互補序列、 SEQ ID N0:6或其互補序列、或者SEQ ID N0:7或其互補序列。
8. 根據權利要求5-7任一項所述檢測樣品中轉基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方 法，其特征在于，所述引物包括至少一種權利要求1-5任一項所述核酸序列。
9. 根據權利要求8所述檢測樣品中轉基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其 特征在于，所述引物包括第一引物和第二引物，所述第一引物選自SEQ ID N0:8和SEQ ID NO: 10 ;所述第二引物選自 SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 11。
10. -種檢測樣品中轉基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其特征在于，包括： 使待檢測樣品與探針接觸，所述探針包括SEQ ID NO: 3或其互補序列中至少11個連續 的核苷酸、或者SEQ ID NO:4或其互補序列中至少11個連續的核苷酸； 使所述待檢測樣品和所述探針在嚴格雜交條件下雜交； 檢測所述待檢測樣品和所述探針的雜交情況。
11. 根據權利要求10所述檢測樣品中轉基因玉米事件DBN9927的DNA存在的方法，其 特征在于，所述探針包括SEQ ID N0:1或其互補序列中第1-