一種地衣芽孢桿菌三角瓶液體發(fā)酵制備耐熱阿魏酸酯酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種地衣芽孢桿菌三角瓶液體發(fā)酵制 備耐熱阿魏酸酯酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A)是普遍存在于植物中的一種天然抗氧化劑，是多種植 物中的一種酚酸，具有鎮(zhèn)靜、抗癌、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集、降血脂等獨(dú)特 的功能。但阿魏酸在植物中大部分以交聯(lián)的形式存在，人和動(dòng)物不能直接吸收這類(lèi)阿魏酸， 必須依靠微生物產(chǎn)生酯酶將阿魏酸游離出來(lái)。另一方面，在植物細(xì)胞壁中，阿魏酸或二聚體 阿魏酸主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上，增強(qiáng)阿拉伯木聚糖鏈的 強(qiáng)度，但從空間上限制了動(dòng)物和微生物對(duì)植物細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解。
[0003] 阿魏酸醋酶（EC 3. 1. 1. 73，feruloyl esterase)又稱(chēng)肉桂酸醋酶或肉桂酰醋酶， 可以水解阿魏酸、二聚阿魏酸形成的酯鍵，將阿魏酸釋放出來(lái)。它能與其他水解酶如木聚糖 酶、纖維素酶和木質(zhì)素酶相互聯(lián)合作用，較為徹底地降解細(xì)胞壁中的多糖和木質(zhì)素。因此， 阿魏酸酯酶在食品、醫(yī)藥、造紙、飼料加工、生物合成及能源開(kāi)發(fā)等諸多領(lǐng)域都有著巨大的 應(yīng)用潛能。
[0004] 自首次在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)阿魏酸酯酶以來(lái)，至今已分離純化近30種阿魏酸酯酶，但 主要集中在青霉和曲霉，只有少數(shù)是來(lái)自于細(xì)菌，例如嗜酸乳桿菌、枯草芽胞桿菌等，而且 它們的阿魏酸酯酶的酶學(xué)特性以及氨基酸序列都有所不同。由于天然真菌生長(zhǎng)、酶產(chǎn)量以 及真菌對(duì)生長(zhǎng)條件的種種限制都制約著酶法制備阿魏酸的工業(yè)化生產(chǎn)。故尋求以細(xì)菌為發(fā) 酵菌株生產(chǎn)阿魏酸酯酶具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，以地衣芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，通過(guò)菌株活 化、種子液培養(yǎng)、三角瓶發(fā)酵、酶制劑制備的工藝步驟制備耐熱阿魏酸酯酶制劑，所得到的 阿魏酸酯酶耐熱性好、pH適用范圍寬、酶活產(chǎn)量高。
[0006] 所述的地衣芽抱桿菌（Baclicus lincheniformis)DBM12,已于2014年1月2日保 藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC (地址為：中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編100101)，保藏編號(hào)：CGMCC No. 8672。
[0007] 所述三角瓶液體發(fā)酵制備耐熱阿魏酸酯酶的方法，包括以下步驟：
[0008] 步驟1，菌株活化：取地衣芽孢桿菌DBM12菌株，在活化培養(yǎng)基平板上劃線，放于 40-45°C溫箱培養(yǎng)18-24h，將生長(zhǎng)好的單菌落進(jìn)行再次劃線，40-45°C溫箱培養(yǎng)18-24h，菌 株活化完成；
[0009] 步驟2,種子液培養(yǎng)：取步驟1所得活化后的平板菌種，接種于50mL -級(jí)種子培 養(yǎng)基中，40_45°C、180r/min振蕩培養(yǎng)24h后，再以10v/v%接種量接種二級(jí)種子培養(yǎng)基， 40-45°C、80r/min振蕩培養(yǎng)20~24h，得二級(jí)種子液；
[0010] 步驟3,三角瓶發(fā)酵：按照5-lOv/v%的接種量將步驟2所得二級(jí)種子液接種到 80-120mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，160-180r/min下震蕩培養(yǎng)，發(fā)酵初始到發(fā)酵24h，培養(yǎng)溫度控制在 40-45°C，發(fā)酵24-36h，溫度降至35-40°C，在發(fā)酵36h時(shí)，向發(fā)酵液中補(bǔ)加營(yíng)養(yǎng)液15mL，繼續(xù) 發(fā)酵至72h ;
[0011] 步驟4,酶制劑的制備：將步驟3所得發(fā)酵液在4°C、8000r/min、離心20min，所得 上清進(jìn)行超濾濃縮，向濃縮后的粗酶液中添加2-3wt%可溶性淀粉，攪拌，再添加8-12wt% 麥芽糊精，攪拌均勻后噴霧干燥，即得阿魏酸酯酶制劑。
[0012] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟1中活化培養(yǎng)基配方為：牛肉膏0. 5g、蛋白胨 lg、NaCllg、瓊脂粉 1. 5g、蒸餾水 100mL，pH 值 7. 0,121°C滅菌 20min。
[0013] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟2中一級(jí)種子培養(yǎng)基配方為：牛肉膏0. 4g、蛋白 胨 0? 8g、酵母粉 lg、NaCl 0? 5g、KH2P040. lg、MgS04 .7H20 0? 04g、蒸餾水 100ml、pH7. 0,121°C 滅菌20min ;二級(jí)種子培養(yǎng)基配方為：豆餅粉lg，玉米粉2g，葡萄糖2. 5g，蛋白胨lg，硫酸按 0? 2g，MgS04 ? 7H20 0? 015g，KH2P040. 008g，定容 100mL，pH 7. 0-7. 4,121°C 滅菌 20min。
[0014] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟3中發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖0. 5g、麩皮浸出 液20mL、蛋白胨lg、酵母粉0. 5g、NaCl 0. 5g、KH2P040. lg、微量元素溶液lmL，蒸餾水100mL、 pH7. 0 ;營(yíng)養(yǎng)液配方：尿素20g、鹿糖50g、玉米衆(zhòng)100mL、胡蘿卜衆(zhòng)500mL、土豆浸出液500mL， 121°C滅菌15min ;其中，麩皮浸出液制備方法：麩皮粉40g，加去離子水500mL，小火煮沸 30min，過(guò)濾，加水定容至500mL ;胡蘿卜漿制備方法：胡蘿卜500g，切成小塊，再同適量去 離子水混合，打漿機(jī)打漿，4層紗布過(guò)濾，加去離子水補(bǔ)充至1000mL ;土豆浸出液制備方法： 土豆500g，切成lcm3小塊，加水1000mL，小火煮30min，4層紗布過(guò)濾，加去離子水補(bǔ)充至 1000mL ;微量元素：CaCl22g/L，MnS04.4H20 0? lg/L，F(xiàn)eS04.7H20 0? 6g/L，ZnS04.7H20 0? 5g/ L，CoCl2 ? 6H20 2g/L，CuS042g/L，MgS04 ? 7H20 0? 5g/L。121°C 滅菌 15min。
[0015] 作為上述發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟4中超濾濃縮分別采用截留分子量為200kDa的 平板式超濾膜和截留分子量為20kDa的平板式超濾膜。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)在于：第一，本發(fā)明的發(fā)酵方法不僅發(fā)酵液后 續(xù)處理簡(jiǎn)便、生產(chǎn)成本低廉，而且發(fā)酵獲得的地衣芽孢桿菌活力在175U/mL以上，與國(guó)內(nèi)外 其他發(fā)酵罐規(guī)模的阿魏酸酯酶生產(chǎn)方法相比，阿魏酸酯酶總產(chǎn)量和酶活力都達(dá)到了較高的 水平，具有極好的工業(yè)化應(yīng)用前景；第二，本發(fā)明得到固體阿魏酸酯酶酶制劑穩(wěn)定性好、適 用范圍廣，酶制劑在37°C溫度下，保存100d，酶活保存在80%以上，阿魏酸酯酶適合在高 溫下酶解，在35°C~65°C之間降解酶活較高，相對(duì)酶活都在80%以上，酶的最適pH范圍在 5. 0-8. 0之間，酶活都在90%以上；第三，本發(fā)明所采用的液體發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，環(huán)保無(wú)毒，原 材料使用豆餅粉、玉米粉、大豆秸桿分、麩皮粉等農(nóng)副產(chǎn)物，成本低廉，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程可控， 不受外部環(huán)境條件限制，非常適合工業(yè)規(guī)?；l(fā)酵罐培養(yǎng)生產(chǎn)；第四，本發(fā)明的阿魏酸酯酶 固體酶制劑制備工藝簡(jiǎn)單，酶活高，酶活力可達(dá)300U/g，總回收率達(dá)到了 82%。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為實(shí)施例3中溫度對(duì)阿魏酸酯酶固體酶制劑儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響；
[0018] 圖2為實(shí)施例3中室溫條件下濕度對(duì)阿魏酸酯酶固體酶制劑儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響；
[0019] 圖3為實(shí)施例3中溫度對(duì)阿魏酸酯酶固體酶制劑酶解活性的影響；
[0020] 圖4為實(shí)施例3中pH對(duì)阿魏酸酯酶固體酶制劑酶解活性的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 地衣芽孢桿菌DBM12的篩選方法，包括以下步驟：
[0023] 步驟1，土樣采集及處理
[0024] 土樣采自江蘇省徐州市云龍區(qū)農(nóng)村正處于高溫發(fā)酵中的家畜糞便堆肥。采集的土 樣置密封的無(wú)菌塑料袋中于室溫保存，并在1周內(nèi)進(jìn)行目的菌株的分離。
[0025] 取5-10g土樣放入裝有20_40mL無(wú)菌水并放有小玻璃珠的三角瓶中，置于搖床上， 120-160r/min旋轉(zhuǎn)震蕩20-30min，然后將三角瓶置于70-80°C水浴加熱15-30min，期間每 隔5min中震蕩一次。
[0026] 步驟2,富集培養(yǎng)
[0027] 取l_2mL熱處理后的土樣于裝有30-50mL富集培養(yǎng)基一的三角瓶中，在160-180r/ min轉(zhuǎn)速50-60°C下震蕩培養(yǎng)20-24h。然后取l-2mL培養(yǎng)液接種到裝有50mL濃度5-10% 的富集培養(yǎng)基二中，繼續(xù)在160_180r/min轉(zhuǎn)速50-60°C下震蕩培養(yǎng)18-20h。
[0028] 富集培養(yǎng)基一：酵母提取物 0? 5g，KH2P040. lg，NH4N030. lg，NaCl 0? lg，MgS04 ? 7H20 0. 25g，微量元素lmL，阿魏酸乙醋lg，去離子水100mL，調(diào)節(jié)pH4. 0。
[0029] 富集培養(yǎng)基二：NH4N030 . 5g，尿素 0? lg，KH2P040. lg，NaCl 0? lg，阿魏酸乙酯 lg，去 離子水100mL，調(diào)節(jié)pH3. 0。
[0030] 微量元素：EDTA 5g，CaCl2 ? 2H20 6g，F(xiàn)eS04 ?